基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的文殊蘭抗腫瘤作用機(jī)制研究

于 淼 ，李佳鑫，辛國松 ，綦 崢 ，薛沁冰 ，王 娟，王楠楠

1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥物工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076

2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，黑龍江 哈爾濱 150076

3.黑龍江省腫瘤預(yù)防與抗腫瘤藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076

文殊蘭Crinum asia ticumL.為石蒜科文殊蘭屬植物，全植株含有生物堿、黃酮、氨基酸類等多種化學(xué)成分[1]。《本草綱目拾遺》中記載文殊蘭：“葉似帶，治折傷損手足者，取葉火煨熱，貼之即愈。”其民間以葉和根狀莖入藥，能夠祛火解毒、消腫散結(jié)[2]。文殊蘭有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗過敏、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗擬膽堿樣等藥理作用[3-4]。文殊蘭鱗莖中含有石蒜堿、恩其明、力克拉敏等多種生物堿[5]，是其主要的抗腫瘤活性成分。

腫瘤是危害當(dāng)今人類健康的重要?dú)⑹郑陙恚S著腫瘤研究的發(fā)展，臨床抗腫瘤藥物的耐藥性和化療后副作用等一系列問題的出現(xiàn)，抗癌中藥的篩選始終是研究熱點(diǎn)[6]。大量研究表明，文殊蘭中的石蒜堿可通過抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用[7-9]，但對文殊蘭中其他成分的相關(guān)報(bào)道很少，因此，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究文殊蘭抗腫瘤的活性成分，以期為該藥的深入研究提供理論基礎(chǔ)。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以準(zhǔn)確展示潛在的藥物-靶點(diǎn)之間的相互作用[10]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)策略（圖1），系統(tǒng)地研究了文殊蘭抗腫瘤的潛在靶點(diǎn)和分子機(jī)制，通過化學(xué)相似性分析、藥效團(tuán)模型篩選和反向?qū)拥确椒▽ζ浞肿影悬c(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。利用各種生物信息學(xué)平臺(tái)識(shí)別病理靶點(diǎn)。然后根據(jù)基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行富集分析，構(gòu)建藥物靶向途徑網(wǎng)絡(luò)。最后，利用分子對接技術(shù)驗(yàn)證文殊蘭與其靶分子之間的相互作用。

圖1 文殊蘭網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析流程Fig.1 Network pharmacology workflow of C.asiaticum

1 材料與實(shí)驗(yàn)

1.1 靶點(diǎn)篩選

通過TCMID 數(shù)據(jù)庫（http://119.3.41.228:8000/ tcmid/herb/6636/）檢索文殊蘭的化學(xué)成分，將所有的化學(xué)成分通過 Swisstargets 數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行吸收、分布代謝、排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，

ADME）參數(shù)的檢索和篩選，將符合要求的化合物納 入，并通過Swisstargets 數(shù)據(jù)庫和Batman 數(shù)據(jù)庫（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）檢索其作用靶點(diǎn)。以腫瘤“tumor”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（ https://www.genecards.org/ ） 和OMIM數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）進(jìn)行檢索。將得到的疾病靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1 軟件找出交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖，作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點(diǎn)。

1.2 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu)建

將藥物疾病交集靶點(diǎn)輸入 String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行初步篩選，再將PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.3 中，通過Network Analyzer 工具進(jìn)行拓?fù)浞治觯远龋╠egree）、中心度（betweenness centrality）、平均最短路徑變化量（average shortest path length）和接近中心性（closeness centrality）4 個(gè)參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過degree 排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)。以關(guān)鍵靶點(diǎn)作為節(jié)點(diǎn)構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對前20 個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)浞治觥?/p>

1.3 GO 通路富集

將藥物疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO 的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cell component，CC）富集，引用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05 的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，并使用R3.6.3，安裝并引用clusterProfiler、enrichplot、ggplot2 包后，繪制柱狀圖。

1.4 KEGG 通路富集及分析

將藥物疾病共有靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，引用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P≤0.05 的項(xiàng)目進(jìn)行篩選，并使用 R3.6.3 軟件，安裝并引用clusterProfiler 包后，繪制與癌癥相關(guān)的相關(guān)通路氣泡圖。將文殊蘭預(yù)測得到的化合物與癌癥相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)和與KEGG 通路富集的癌癥相關(guān)的通路作為節(jié)點(diǎn)構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，并利用軟件Cytoscape 3.6.3 對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化處理并分析主要作用通路。

1.5 分子對接

將篩選出的主要活性成分通過PubChem 下載SDF 格式；將關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)通過PDB 數(shù)據(jù)庫，盡量選擇分辨率Resolution（A）高，有配體、結(jié)構(gòu)相對完整的晶體結(jié)構(gòu)，并下載PDB 格式文件。

將配體分子導(dǎo)入PyRx 軟件[11]進(jìn)行能量最小化處理。蛋白導(dǎo)入Auto Dock Tools，進(jìn)行除水、加氫、計(jì)算電荷，原子類型設(shè)為Assign AD4 type。將處理好的配體分子導(dǎo)入PyRx 軟件的Ligands 選項(xiàng)；蛋白導(dǎo)入Macromolecules選項(xiàng)，進(jìn)行Run Vina計(jì)算分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分及其對應(yīng)靶點(diǎn)的采集

通過TCMID 數(shù)據(jù)庫檢索文殊蘭的化學(xué)成分，將所有的化學(xué)成分通過Swisstargets 數(shù)據(jù)庫ADME參數(shù)的檢索和篩選，得到15 個(gè)符合要求的化合物，見表1。

2.2 癌癥靶點(diǎn)基因與文殊蘭治療靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析

通過Swisstargets 和Batman 數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到文殊蘭主要成分的相關(guān)靶點(diǎn)，去重，共得到585 個(gè)基因靶點(diǎn)。依據(jù)GeneCards、NCBI 數(shù)據(jù)庫挖掘得到癌癥相關(guān)基因，去重后得到6538 個(gè)靶點(diǎn)，將篩選出的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入Venny 2.1，得到339 個(gè)共有靶點(diǎn)（圖2），作為藥物作用于疾病的預(yù)測靶點(diǎn)。

表1 篩選出的化學(xué)成分信息Table 1 Information of selected chemical composition

圖2 文殊蘭抗腫瘤韋恩圖Fig.2 Antitumor Venny diagram in C.asiaticum

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的建立和分析

將得到的文殊蘭靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cystoscape 3.6.3 中，通過度排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共篩選出118 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（圖3），節(jié)點(diǎn)顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，越大、顏色越深，度值越大。將排名前15 個(gè)靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)并使用R3.6.3 進(jìn)行拓?fù)浞治觯▓D4）。

圖3 文殊蘭蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein interaction network of C.asiaticum

圖4 核心癌癥靶點(diǎn)的拓?fù)浞治鯢ig.4 Topological analysis of core cancer targets

2.4 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用Cytoscape 3.6.3 軟件處理得到文殊蘭“成分- 靶點(diǎn)-疾病”相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖5）。網(wǎng)絡(luò)中黃色為藥物作用于疾病的靶點(diǎn)，藍(lán)色為文殊蘭活性成分。表明文殊蘭的抗腫瘤作用是基于多成分、多基因、多靶點(diǎn)的協(xié)同復(fù)雜作用。

圖5 成分-靶點(diǎn)-疾病相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Composition-target-disease interaction network

2.5 GO 富集分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，根據(jù)錯(cuò)誤發(fā)生率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05，篩選出BP（如黏附、遷移、凋亡、周期等）2691 個(gè)，CC（如細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等）225 個(gè)，MF 164 個(gè)，根據(jù)Count 值排序，取前10，結(jié)果如圖6 所示，細(xì)胞生物過程富集的基因數(shù)較多，F(xiàn)DR 值較低，說明文殊蘭主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生物過程發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖6 GO 富集分析結(jié)果Fig.6 Analysis results of GO enrichment

2.6 KEGG 通路富集分析

KEGG 分析共富集到168 條信號通路，其中25條癌癥相關(guān)通路，并對25 條通路進(jìn)行可視化處理（圖7）。根據(jù)KEGG 通路分析，文殊蘭可能對前列 腺癌（prostate cancer）、胰腺癌（pancreatic cancer）、非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer）等多種癌癥有治療作用，文殊蘭靶點(diǎn)-通路相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系見圖8，其與prostate cancer 信號通路的靶點(diǎn)作用關(guān)系見圖9。

圖7 KEGG 富集分析氣泡圖Fig.7 Bubble diagram of KEGG enrichment analysis

圖8 文殊蘭“通路-靶點(diǎn)”相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.8 “Pathway-target” network of C.asiaticum

圖9 文殊蘭與prostate cancer 信號通路的相關(guān)靶點(diǎn)作用關(guān)系Fig.9 Related target action relationship between C.asiaticum and prostate cancer signaling pathway

2.7 分子對接

對篩選出核心化合物和前15 個(gè)潛在核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，對接結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)誤差（root mean square deviation，RMSD）與原配體的RMSD 分別進(jìn)行模型表征對比，以最低值為篩選條件。通常認(rèn)為，配體和受體的構(gòu)象越穩(wěn)定，能量越低，結(jié)合的可能性越大[12]。經(jīng)PyRx 對接，得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖分析（圖10，紅色越深，結(jié)合自由能越高）。本研究結(jié)合自由能小于-5 kJ/mol 的活性成分有202 個(gè)，占90%；小于-9 kJ/mol 的活性成分有12 個(gè)，占5.3%，可見這些核心化合物與受體結(jié)合活性較高，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。本研究以結(jié)合能≤-9.0 kJ/mol 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，用Pymol 2.3 軟件進(jìn)行可視化（圖11）。

圖10 分子對接分?jǐn)?shù)的熱圖分析Fig.10 Thermal diagram analysis of molecular docking fraction

圖11 文殊蘭活性成分與核心靶點(diǎn)分子對接可視化 (結(jié)合能≤-9 kJ/mol)Fig.11 Visualization of docking between active components and core target molecules of C.asiaticum (affinity ≤ -9 kJ/mol)

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[13]的方法，探索多組分、多靶點(diǎn)、多通路的復(fù)雜中藥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，發(fā)現(xiàn)文殊蘭抗腫瘤的主要活性成分為生 物堿類，確認(rèn)文殊蘭亭堿、石蒜胺和小星蒜堿等15個(gè)抗腫瘤活性成分，以及15 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括胰島素（insulin，INS）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ，GAPDH）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGFA）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。KEGG 富集出的通路與癌癥相關(guān)的有25 條，并通過分子對接技術(shù)進(jìn)行半柔性對接，結(jié)果顯示化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)均有結(jié)合活性，結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，前列腺癌、多聚糖腫瘤信號通路等與文殊蘭抗腫瘤作用密切相關(guān)。因此，推斷出文殊蘭對前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌等多種癌癥有治療作用。

對接過程中，活性中心Gridbox 的大小設(shè)置合理與否會(huì)直接影響到分子對接的準(zhǔn)確性，故本研究以原配體抑制劑為活性口區(qū)域，合理設(shè)置分子對接的Gridbox 大小。本研究通過TCMID、PubChem數(shù)據(jù)庫從文殊蘭中篩選出15 個(gè)化合物，分別與15個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行了分子對接。文殊蘭中結(jié)合能小于-5 kJ/mol 的活性成分有202 個(gè)，占90%；小于-9 kJ/mol 的活性成分有12 個(gè)，占5.3%。已有研究表明，文殊蘭中的菲啶型生物堿（水仙明、恩其明、石蒜寧堿等）、石蒜型生物堿（石蒜堿）、lycorenine型生物堿（石蒜寧堿）是其主要的抗腫瘤活性成分[6]，且Lycorenine 型生物堿活性大于石蒜型生物堿。結(jié)合分子對接結(jié)果，推測菲啶型生物堿、石蒜型生物堿、lycorenine 型生物堿可能在文殊蘭發(fā)揮潛在抗腫瘤作用中具有較大貢獻(xiàn)。

分子對接結(jié)果顯示，文殊蘭亭堿與VEGFA、EGFR、絲裂原活化蛋白激酶（1mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、MAPK8、雌激素受體α（estrogen receptor alpha，ESR1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）等關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均≤-9 kJ/mol，說明文殊蘭亭堿與以上靶點(diǎn)能很好的結(jié)合，同時(shí)KEGG 富集分析到得的與癌癥相關(guān)的通路大多涉及到以上基因。已研究表明，文殊蘭亭堿對胰腺癌PNAC-1-LUC 細(xì)胞、惡性黑色素瘤細(xì)胞SK-MEL-2、乳腺癌ZR-75-1 細(xì)胞等一系列腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用[14]。小星蒜堿與mTOR 結(jié)合能力較好，mTOR 相關(guān)信號通路磷脂酰肌醇-3- 羥激酶（ phosphatidylinositol-3- hydroxykinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/mTOR 的激活與列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，在臨床上常用PI3k/Akt/mTOR 通路抑制劑治療前列腺癌[15-16]。因此，推測文殊蘭中的核心化合物通過作用關(guān)鍵靶點(diǎn)VEGFA、EGFR、MAPK1、MAPK8、ESR1、mTOR 等調(diào)控前列腺通路、胰腺癌通路、非小細(xì)胞肺癌通路、黑色素瘤通路、乳腺癌通路等信號通路起到抗腫瘤作用。

在這些關(guān)鍵基因中，Caspase-3 是半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，研究發(fā)現(xiàn)Caspase-3 的過度表達(dá)可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞細(xì)胞的成熟并提高其抗腫瘤能力[17]。Caspase-3 是一種常被激活的死亡蛋白酶，催化其特異性裂解許多關(guān)鍵的細(xì)胞蛋白[18]。體外實(shí)驗(yàn)表明，小星蒜堿能降低Caspase-3 的表達(dá)，誘導(dǎo)小鼠肉瘤S180細(xì)胞凋亡[19]。同時(shí)，小星蒜堿能顯著抑制人結(jié)腸癌Ht-29細(xì)胞和肝癌Hepg2細(xì)胞的增殖[20]。甜菜堿型生物堿氧化石蒜堿對9 種腫瘤細(xì)胞株具有細(xì)胞毒作用，其機(jī)制可能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死、自噬以及Caspases 激活介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡、激活基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）通路和活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成[21]。非洲防已苦素是一類二萜類呋喃化合物，具有多種藥理活性，包括抗炎、抗腫瘤、體內(nèi)抑制酶活性等[22]。非洲防已苦素通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，顯著抑制偶氮甲烷誘導(dǎo)大鼠結(jié)腸發(fā)育的進(jìn)展[23]。水仙明被發(fā)現(xiàn)是一種新的抗腫瘤細(xì)胞增殖藥物，對人急性淋巴細(xì)胞白血病CEM 細(xì)胞具有明顯的抑制細(xì)胞周期紊亂和凋亡誘導(dǎo)作用，其機(jī)制可能是由Caspase 級聯(lián)激活介導(dǎo)的凋亡作用[24]。這與KEGG 分析結(jié)果相符合，Caspase 可能是結(jié)腸癌信號通路、白血病信號通路等通路的關(guān)鍵靶點(diǎn)，由此可以推斷，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是文殊蘭成分抗腫瘤作用的重要機(jī)制。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接相結(jié)合的方法，確認(rèn)文殊蘭抗腫瘤活性成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)和信號通路，并基于分子對接初步模擬其可能分子作用機(jī)制。本研究結(jié)果為后續(xù)文殊蘭的研究提供了理論基礎(chǔ)和重要依據(jù)，這些信息可能有助于闡明文殊蘭抗腫瘤的基本機(jī)制和識(shí)別潛在靶點(diǎn)，但未來需要對靶點(diǎn)和特定相互作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突