槐定堿對永久性大腦中動脈栓塞大鼠腦細胞的作用及機制研究

薛玉梅，李獻軍，孟 巖，宋 哲，劉惠欽，李曉兵*

1.石家莊市人民醫院 神經內科，河北 石家莊 050027

2.石家莊市人民醫院 藥學部，河北 石家莊 050027

腦梗死是臨床中常見的腦血管疾病，組織缺血缺氧導致壞死或軟化，嚴重危害人類的生命。細胞凋亡是腦梗死引起神經損傷的重要機制之一，缺血缺氧下凋亡相關信號通路激活，引起神經細胞凋亡，腦梗死灶體積和神經功能缺損嚴重程度與細胞凋亡程度呈正相關[1]。槐定堿是從豆科槐屬植物苦豆子Sophora alopecuroidesL.中提取分離的單體生物堿，具有抑制炎性因子分泌、抗氧化、抗癌、保護心腦血管等作用[2-3]。槐定堿能夠通過下調腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptorassociated factor6，TRAF6）、上調磷酸化細胞外信號調節激酶1/2（extracellular regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）表達，從而減輕大鼠腦損傷和腦水腫程度[4]。本課題組前期研究表明，槐定堿能夠抑制氧化應激和炎性反應，對局灶性腦缺血大鼠具有神經保護作用[5]。本研究探究槐定堿對永久性大腦中動脈栓塞（permanent middle cerebral artery occlusion，pMCAO）大鼠腦細胞凋亡的影響，為槐定堿的臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 動物

清潔級SD 大鼠70 只，雌雄各半，8 周齡，體質量240～275 g，購自寧夏醫科大學實驗動物中心，動物許可證號SYXK（寧）20100001。動物于溫度（24±1）℃、濕度50%～70%的環境中適應性飼養1 周，自由進食飲水。動物實驗經石家莊市人民醫院倫理委員會批準（批準號2016017）。

1.2 藥品與試劑

槐定堿（質量分數＞98%，批號960324）購自寧夏藥物研究所；BCA 蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（批號T8170）購自北京索萊寶科技有限公司；兔源B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）抗體（批號sc-492）購自美國Santa Cruz 公司；兔源Bcl-2 相關X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體（批號2772s）、兔源半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（批號9662s）、β-actin 抗體（批號4970s）、HRP 標記的山羊抗兔抗體購自美國CST 公司。

1.3 儀器

PAC 1000 電泳儀、FACSCanto 流式細胞儀、GelDoc XR＋凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；TS-8S 型雙層脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；JY92-ⅡD 型超聲波細胞破碎機（南京貝帝實驗儀器有限公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

SD 大鼠隨機分為對照組、模型組及槐定堿低、中、高劑量（2.5、5.0、10.0 mg/kg）組[4]，每組14只。槐定堿溶于0.9%氯化鈉溶液，分別配制成質量濃度為2.5、5.0、10.0 mg/mL 的溶液。各給藥組ip相應溶液（1 mL/kg），對照組和模型組ip 等體積0.9%氯化鈉溶液，1 次/d，連續5 d。末次給藥后，模型組和各給藥組立即制備pMCAO 模型。

2.2 pMCAO 模型的制備

采用Longa 改良線栓法[6]建立大鼠pMCAO 模型，大鼠ip 20%烏拉坦（6 mL/kg）麻醉后，于頸部正中切口并進行動脈分離，結扎右側頸總動脈近心端，在頸內動脈下方穿線備用；在右側頸總動脈距離分叉約4 mm 處剪口，將栓線經過頸內動脈插入大腦中動脈起始端（栓線最遠端距分叉處18～20 mm），阻斷大腦中動脈供血；結扎頸內動脈固定拴線，記錄時間作為大腦局灶性缺血開始的時間，線栓阻斷血流24 h。對照組僅進行動脈分離，不插線。

2.3 槐定堿對pMCAO 大鼠神經功能評分的影響

術后大鼠進行神經行為癥狀評分，判定神經功能損傷程度[6]。評分標準：0 分為大鼠無神經功能缺失癥狀；1 分為大鼠梗死對側前爪內收、不能伸展對側前肢；2 分為大鼠前肢屈曲對側抵抗推力下降，行走時向偏癱側旋轉；3 分為大鼠行走時向偏癱側傾倒；4 分為大鼠不能自發行走，意識喪失。

2.4 槐定堿對pMCAO 大鼠腦梗死率的影響

術后各組隨機選取5 只大鼠，斷頭處死，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，以2 mm 為間隔行腦組織冠狀切片，于2% TTC 染液中避光孵育30 min，于4%多聚甲醛溶液中固定1 h，拍照并觀察梗死情況，紅色區域為正常腦組織，白色區域為梗死病變的腦組織，采用Image J 軟件計算腦梗死率[7]。

2.5 槐定堿對pMCAO 大鼠缺血半暗帶區細胞凋亡的影響

大鼠ip 20%烏拉坦麻醉，打開胸腔，用200 mL 4%多聚甲醛進行心臟灌注。大鼠斷頭處死，取60 mg大腦缺血半暗帶區組織，即右側大腦半球距離嗅球尖端7～11 mm 額頂皮質上部，制成單細胞懸液，調整細胞密度至1×109/L，2000 r/min 離心5 min，棄上清，細胞沉淀加入5 μL Annexin V-FITC 和PI，避光孵育，再加入490 μL 1×Binding Buffer，采用流式細胞儀于1 h 內檢測細胞凋亡情況[8]。

2.6 槐定堿對pMCAO 大鼠腦組織病理變化的影響

大鼠斷頭取腦，取缺血部位腦組織，于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度乙醇脫水、無水乙醇及二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋后切片（厚5 μm），冠狀切片貼于載玻片上，于4 ℃保存；石蠟切片經脫蠟、染色、脫水、透明后，中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

2.7 槐定堿對pMCAO 大鼠腦組織Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達的影響

取大鼠缺血部位腦組織，于液氮中研碎，加入裂解液提取總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別加入Bcl-2、Bax、Caspase-3 和β-actin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP標記的山羊抗兔抗體室溫孵育2 h，加入ECL 試劑顯影，采用Quantity One 軟件分析。

2.8 統計學處理

數據以±s表示，采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，多組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩之間比較采用最小顯著差數法。

3 結果

3.1 槐定堿對pMCAO 大鼠神經功能評分的影響

如表1 所示，對照組大鼠神經功能正常，模型組大鼠出現缺血對側前肢不能伸直、轉圈等不同程度的神經缺陷癥狀。與模型組相比，各給藥組大鼠神經缺陷癥狀得到改善。

3.2 槐定堿對pMCAO 大鼠腦梗死率的影響

如圖1 所示，與對照組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，槐定堿中、高劑量組大鼠腦梗死率顯著降低（P＜0.05、0.01）。

3.3 槐定堿對pMCAO 大鼠缺血半暗帶區細胞凋亡的影響

如圖2 所示，與對照組比較，模型組大鼠缺血半暗帶細胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠缺血半暗帶細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05、0.01）。

表1 槐定堿對pMCAO 大鼠神經功能評分的影響 (± s, n = 14)Table 1 Effect of sophoridine on neurological score in pMCAO rats (± s, n = 14)

表1 槐定堿對pMCAO 大鼠神經功能評分的影響 (± s, n = 14)Table 1 Effect of sophoridine on neurological score in pMCAO rats (± s, n = 14)

劑量/(mg·kg-1) 0 分 1 分 神經功2 分能 評 分 3 分 — 14 0 0 0 — 0 0 3 8 組別 4 分 對照 0 模型 3 槐定堿 2.5 0 1 6 7 0 5.0 0 1 9 4 0 10.0 0 3 9 2 0

圖1 槐定堿對pMCAO 大鼠腦梗死率的影響 ( ± s , n=5)Fig.1 Effect of sophoridine on cerebral infarction rate in pMCAO rats ( ± s , n=5)

圖2 槐定堿對pMCAO 大鼠缺血半暗帶區細胞凋亡的影響 (± s, n = 9)Fig.2 Effect of sophoridine on apoptosis of ischemic penumbra in pMCAO rats (± s, n = 9)

3.4 槐定堿對pMCAO 大鼠腦組織病理變化的影響

如圖3 所示，對照組大鼠大腦皮質結構完整，神經細胞排列及形態正常，胞膜完整，胞質豐富，核仁清楚；模型組大鼠大腦皮質廣泛水腫，細胞排列紊亂，胞質空泡樣變，部分核固縮，核仁消失，神經元數目明顯減少，間質血管擴張充血，炎性細胞浸潤；與模型組相比，各給藥組大鼠腦組織水腫減輕，神經細胞形態有所改善，核固縮和核溶解程度減輕，細胞凋亡與壞死減少，神經元數目增加。

圖3 槐定堿對pMCAO 大鼠腦組織病理變化的影響Fig.3 Effect of sophoridine on pathological changes of brain tissue in pMCAO rats

3.5 槐定堿對大鼠pMCAO 腦組織Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達的影響

如圖4 所示，與對照組比較，模型組大鼠腦組織Bcl-2 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），Bax和Caspase-3 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織Bcl-2 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05、0.01），Bax 蛋白表達水平 顯著降低（P＜0.05、0.01），槐定堿中、高劑量組Caspase-3 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）。

圖4 槐定堿對pMCAO 大鼠腦組織Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達的影響 (± s, n = 9)Fig.4 Effect of sophoridine on expressions of Bcl-2, Bax, and Caspase-3 in brain tissue of pMCAO rats (± s, n = 9)

4 討論

缺血性腦卒中是臨床上常見且多發的疾病，其病理過程涉及腦組織能量代謝障礙、神經細胞內鈣超載、氧化應激損傷、炎性反應、細胞凋亡等多個環節，其中神經細胞凋亡是腦缺血損傷的重要環節[9]。腦細胞缺血缺氧后，腦梗死區域與正常腦組織間存在以細胞凋亡為主的缺血半暗帶區，通過調節該區域神經細胞的凋亡，能夠有效減少神經細胞壞死數量和梗死區域面積，減輕神經功能損傷[10]。因此，及時、有效地阻止腦缺血后神經細胞凋亡，對減輕腦缺血損傷尤為重要。研究發現，中藥能夠通過調節線粒體凋亡途徑抑制細胞凋亡，從而發揮腦神經保護作用[11]。課題組前期研究發現，槐定堿對局灶性腦缺血大鼠模型具有神經保護作用。

Bcl-2 家族蛋白在線粒體介導的細胞凋亡中發揮著關鍵性作用，能夠通過控制線粒體膜的通透性，影響凋亡相關因子的釋放，進而調控細胞凋亡[12]。由線粒體釋放的細胞色素C（cytochrome C，CytC）與凋亡蛋白酶激活因子-1（apoptotic protease activating factor 1，Apaf-1）結合形成凋亡小體，進而促進Caspase 前體活化，啟動Caspase 級聯反應[13]。Caspase 家族是細胞凋亡的效應器，能夠引發細胞骨架重排、DNA 斷裂等細胞生化和形態學的改變，Caspase-3 是Caspase 級聯反應下游最關鍵的凋亡執行蛋白酶，Caspase-3 的活化可引起細胞凋亡[14]。Bax 為促凋亡蛋白，能夠增加線粒體外膜通透性，促進凋亡相關因子的釋放；Bcl-2 為抗凋亡蛋白，通過與Bax形成異源二聚體，抑制Bax的促凋亡作用[15]。研究發現，急性腦梗死患者血清中Bcl-2 表達明顯下降[12]。Bcl-2 與Bax 之間的平衡維持著細胞凋亡的穩態，腦缺血后Bcl-2/Bax 下降，Caspase-3 被激活，進而導致凋亡的發生[16]。

本研究結果顯示，腦缺血24 h 后大鼠神經功能缺陷癥狀明顯且細胞凋亡率顯著增加，槐定堿能夠明顯改善pMCAO 大鼠的神經功能癥狀，減小腦梗死率，降低缺血半暗帶處細胞的凋亡率，減輕pMCAO 大鼠病理性損傷，維持細胞的正常形態，抑制神經細胞凋亡和壞死。大鼠局灶性腦缺血后神經細胞的死亡可能與Bcl-2、Bax 和Caspase-3 凋亡途徑的激活有關，本研究發現，槐定堿能夠抑制pMCAO 大鼠腦組織Bax 的上調和Bcl-2 的下調，維持Bcl-2 與Bax 之間的平衡，從而抑制Caspase-3的上調，從而抑制腦缺血后神經細胞凋亡。

綜上，槐定堿能夠通過改善腦細胞凋亡情況、減輕pMCAO 大鼠神經損傷程度，從而發揮神經保護作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突