葛根素通過circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4抑制SK-N-SH細胞氧糖剝奪損傷

齊獻忠，邢英瀛，張小林，賈燕燕

南陽市中心醫院 神經內科，河南 南陽 473000

腦卒中是導致殘疾的主要原因，也是全球第2大常見的死亡原因[1]。約87%腦卒中病例為缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS），IS 的死亡率和致殘率一直處于較高水平[2]。有效保護神經元損傷在IS防治中至關重要[3]。葛根素是從豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.) Ohwi 的根中提取的異黃酮苷類物質，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用[4]。葛根素被廣泛用于治療急性缺血性中風、心臟病和其他全身性疾病[5-6]。環狀RNA（circRNA）通過微小RNA（miRNA）或與RNA 結合蛋白相互作用形成circRNA-miRNA-mRNA 復合物，在轉錄后基因表達的調節中起關鍵作用[7]。研究發現，circRNA 可能參與了IS 的發病過程，具有作為IS的新型診斷生物標志物和分子治療靶點的潛力[8-9]。在IS 患者和動物模型中，circ-絲氨酸/蘇氨酸蛋白擾動樣激酶1（tousled-like kinase1，TLK1）表達明顯上調，敲除circ-TLK1能夠顯著減少腦梗死體積，減少缺血性神經元損害并改善神經功能缺損[10]。因此，本研究基于circ-TLK1 探究葛根素對IS 的神經細胞保護作用及機制。

1 材料

1.1 細胞

人神經母細胞瘤細胞 SK-N-SH 購自美國ATCC。

1.2 藥品與試劑

葛根素（質量分數≥98%，批號110752-201912）購自中國藥品生物制品檢定所；DMEM 高糖培養基（批號1912）購自美國Hyclone 公司；胎牛血清（批號SN201909）購自美國Gibco 公司；Lipofectamine 3000轉染試劑（批號L3000-015）購自美國Invitrogen公司；MTT（批號MKBP6775V）購自美國Sigma公司；circ-TLK1過表達載體及空載 Vector、circ-TLK1小干擾RNA（si-circ-TLK1）、siRNA 陰性對照（si-NC）、miR-367-3p模擬物（miR-367-3p mimics）、miR-367-3p抑制劑（miR-367-3p inhibitors）及相應對照、Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）過表達載體質粒和空載pcDNA 均由上海吉瑪制藥技術有限公司合成；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 檢測試劑盒（批號20191120）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 檢測試劑盒（批號20190608）購自上海酶聯生物科技有限公司；Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒（批號MK1020）購自日本Takara 公司；雙熒光素酶標記試劑盒（批號E2920）、pmirGLO 載體（批號E1330）購自美國Promega 公司；RNA 結合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation，RIP，批號KT102-01）購自美國Millipore 公司；TLR4 單抗、HRP 標記的IgG 二抗購自美國CST 公司；RIPA 裂解液（批號P0013）購自上海碧云天生物技術有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號PC0020）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 儀器

CR21GⅡ型低溫高速離心機購自日本日立公司；T-1186-340-LA 型超低溫冰箱購自天地精儀科技；MAXM5 型多功能酶標儀購自美谷分子儀器；YXQ-LS-75G 型高壓滅菌鍋購自諾基儀器；流式細胞儀購自北京儀美信科技。

2 方法

2.1 細胞培養

SK-N-SH 細胞用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養箱中培養。

2.2 氧糖剝奪（oxygen-glucose deprivation，OGD）對SK-N-SH 細胞存活率的影響

取處于對數生長期的SK-N-SH 細胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，待細胞貼壁后使用PBS 洗滌3 次，用不含血清、無糖的DMEM 培養基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養箱中分別培養6、12、24 h；將培養基更換成DMEM 高糖培養基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養箱中培養24 h，建立OGD 細胞模型[11]。加入100 μL MTT 孵育4 h，棄上清，加入二甲基亞砜（DMSO），振蕩至結晶完全溶解，采用酶標儀測定490 nm 處的吸光度（A），計算細胞存活率。

2.3 細胞轉染

取處于對數生長期的SK-N-SH 細胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，培養12 h，待細胞融合度達到50%時，按照試劑盒說明書將circ-TLK1過表達載體及空載Vector、si-circ-TLK1（5’-GGACATCTCAAA- AAGGCAACA-3’）及si-NC、miR-367-3pmimics、miR-367-3pinhibitors 及相應對照、TLR4過表達載體質粒及空載pcDNA 轉染至SK-N-SH 細胞。

2.4 MTT 法檢測細胞存活率

取處于對數生長期的SK-N-SH 細胞，以2×104/孔接種于6 孔板中，培養12 h，加入不同質量濃度（20、40、80 μg/mL）的葛根素或用質粒轉染，對照組加入不含藥物的無糖DMEM 培養基，于5% CO2、1% O2、94% N2、37 ℃的培養箱中培養12 h；將培養基更換成DMEM 高糖培養基，于5% CO2、飽和濕度、37 ℃的培養箱中培養24 h。按“2.2”項下方法檢測細胞存活率。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

按“2.4”項下方法處理細胞，收集細胞，分別加入Annexin V-FITC 和PI 染液，孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.6 ELISA 法檢測上清液中IL-6 和TNF-α 水平

按“2.4”項下方法處理細胞，收集上清液，按ELISA 試劑盒說明書測定IL-6 和TNF-α 水平。

2.7 qRT-PCR 檢測 circ-TLK1 和 miR-367-3p mRNA 表達情況

按“2.4”項下方法處理細胞，收集細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物序列見表1，將U6作為miR-367-3p內參，將GAPDH作為circ-TLK1內參。

2.8 雙熒光素酶標記實驗檢測熒光素酶活性

將包含miR-367-3p結合位點的circ-TLK1的野生型序列（WT-circ-TLK1）或不具有miR-367-3p 結合位點的突變體（MUT-circ-TLK1）插入pmirGLO載體，將質粒與miR-367-3p mimics或miR-NC共轉染至SK-N-SH 細胞，采用雙熒光素酶標記試劑盒考察熒光素酶活性。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.9 RIP 實驗檢測miR-367-3p 與circ-TLK1 和TLR4 結合關系

以預冷的PBS 洗滌SK-N-SH 細胞2 次，加入裂解液于冰上裂解，收集上清液，于 -80 ℃保存。制備重懸磁珠，加入IgG 或Ago2 抗體孵育，棄上清，以洗滌液洗滌3 次，加入免疫沉淀緩沖液，離心取上清，提取免疫沉淀的RNA，并通過qRT-PCR檢測，以確認結合靶點的富集水平。

2.10 Western blotting 法檢測TLR4 蛋白表達情況

按“2.4”項下方法處理細胞，收集細胞，加入RIPA 裂解液，提取蛋白，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，于5%脫脂牛奶封閉2 h，加入TLR4 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗滌3 次后，加入HRP 標記的IgG 二抗，孵育2 h，使用ECL 試劑盒顯色，采用Image J軟件分析。

2.11 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計學分析，數據以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。

3 結果

3.1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷

如圖1-A 所示，隨著OGD 作用時間的延長，SK-N-SH 細胞存活率顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001），后續選擇12 h 作為OGD 的處理時間。如圖1-B～D 所示，與對照組比較，模型組細胞存活率顯著降低（P＜0.001），凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，葛根素組細胞存活率顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001），細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01、0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.01、0.001），表明葛根素對OGD 致細胞損傷具有保護作用，選擇40 μg/mL 葛根素進行后續研究。

圖1 葛根素抑制OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷Fig.1 Puerarin inhibited SK-N-SH cells damage induced by OGD

3.2 過表達circ-TLK1 逆轉葛根素對OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷的保護作用

如圖2 所示，與對照組比較，模型組細胞circ-TLK1mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，葛根素組細胞circ-TLK1mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001），表明葛根素對OGD致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用可能與circ-TLK1的表達有關。轉染過表達circ-TLK1后，細胞circ-TLK1mRNA 表達水平表達顯著升高（P＜0.001），細胞存活率顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.01、0.001），表明過表達circ-TLK1能夠逆轉葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用。

圖2 過表達circ-TLK1 逆轉葛根素對OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷的保護作用Fig.2 Overexpression of circ-TLK1 reversed protective effect of puerarin on SK-N-SH cells injury induced by OGD

3.3 葛根素通過circ-TLK1 靶向調控miR-367-3p對OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷的保護作用

如圖3 所示，采用生物信息學在線軟件預測circ-TLK1的下游靶點，發現miR-367-3p和circ-TLK1間存在特異性靶向結合位點，提示miR-367-3p可能是circ-TLK1的直接靶點。采用雙熒光素酶報告基因實驗和RIP 實驗驗證miR-367-3p和circ-TLK1的靶向關系，結果顯示，與miR-NC組相比，miR-367-3p 組WT-circ-TLK1 熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.001），MUT-circ-TLK1 熒光素酶相對活性無明顯改變；與IgG 組相比，Ago2組miR-367-3p和circ-TLK1的富集水平均顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通過結合位點與circ-TLK1特異性結合。

圖3 circ-TLK1 與miR-367-3p 靶向調控作用Fig.3 Targeted regulation of circ-TLK1 and miR-367-3p

與對照組相比，模型組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001）；與si-NC 組相比，si-circ-TLK1組circ-TLK1mRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.01）；與Vector組相比，circ-TLK1 組circ-TLK1mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.001），miR-367-3pmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），表明circ-TLK1能夠靶向負調控miR-367-3p的表達。

如圖4 所示，與對照組相比，模型組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，葛根素組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.001），表明葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用可能與miR-367-3p的表達有關。通過轉染抑制miR-367-3p表達，結果顯示，與葛根素＋anti-miR-NC 組相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.001），細胞存活率顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001），表明抑制miR-367-3p能夠逆轉葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用。

圖4 葛根素通過促進miR-367-3p 表達對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷發揮保護作用Fig.4 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by promoting miR-367-3p expression

3.4 葛根素通過miR-367-3p 靶向調控TLR4 對OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷的保護作用

如圖5 所示，采用生物信息學在線軟件預測miR-367-3p的下游靶基因，發現miR-367-3p和TLR4間存在特異性靶向結合位點，提示TLR4可能是miR-367-3p的直接靶基因。采用雙熒光素酶報告基因實驗和RIP 實驗驗證miR-367-3p和TLR4的靶向關系，結果顯示，與miR-NC 組相比，miR-367-3p組WT-TLR4 熒光素酶相對活性顯著降低（P＜0.001），MUT-TLR4 熒光素酶相對活性無明顯改變；與IgG 組相比，Ago2 組TLR4和circ-TLK1的富集水平顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p可通過結合位點與TLR4特異性結合。

圖5 TLR4 和miR-367-3p 靶向調控作用Fig.5 Targeted regulation of TLR4 and miR-367-3p

與對照組相比，模型組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與miR-NC 組相比，miR-367-3p組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著升高（P＜0.001），TLR4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001）；與 anti-miR-NC組相比， anti-miR-367-3p 組miR-367-3pmRNA 表達水平顯著降低（P＜0.05），TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001），表明miR-367-3p能夠靶向負調控TLR4表達。

如圖6 所示，與對照組相比，模型組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組相比，葛根素組TLR4蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001），表明葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用可能與TLR4 表達有關。通過轉染過表達TLR4，結果顯示，與葛根素＋pcDNA 組相比，葛根素＋TLR4 組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001），細胞存活率顯著降低（P＜0.05），細胞凋亡率顯著升高（P＜0.001），IL-6 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.001），表明過表達TLR4能夠逆轉葛根素對OGD致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用。

圖6 葛根素通過抑制TLR4 表達對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷發揮保護作用Fig.6 Puerarin protected SK-N-SH cells from OGD induced damage by inhibiting TLR4 expression

3.5 葛根素通過調控 circ-TLK1/miR-367-3p/ TLR4 抑制OGD 所致的SK-N-SH 細胞損傷

如圖7 所示，與對照組相比，模型組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與si-NC 組相比，si-circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001）；與si-circ-TLK1＋anti-miR-NC 組相比，si-circ-TLK1＋anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，葛根素組TLR4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001）；與葛根素＋Vector 組相比，葛根素＋circ-TLK1 組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.001）；與葛根素＋anti-miR-NC 組相比，葛根素＋anti-miR-367-3p 組TLR4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）。

圖7 葛根素對circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 的調控作用Fig.7 Regulatory effect of puerarin on circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4

4 討論

IS 為危害我國中老年人健康及生活質量的主要疾病，具有高發病率、高致殘率、高死亡率及高復發率等特點[12-13]。研究發現，葛根中的葛根素可以改善血液循環并減少心血管和腦血管疾病；葛根素能夠減少腦缺血再灌注引起的神經元損傷，并降低腦卒中神經細胞損傷過程[14-17]。本研究發現葛根素可以有效提高OGD 誘導的SK-N-SH 細胞存活率，降低細胞凋亡率，降低IL-6 和TNF-α 水平，表明葛根素對IS 神經細胞損傷具有保護作用。

CircRNA 在組織中特異性表達，具有高度同源性、結構穩定等特點[18-19]。本研究結果顯示，OGD誘導的SK-N-SH 細胞中circ-TLK1mRNA 表達水平顯著升高，與文獻報道一致[10]；葛根素顯著下調circ-TLK1mRNA 表達，過表達circ-TLK1能夠逆轉葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用，表明葛根素通過降低SK-N-SH 細胞中circ-TLK1表達，從而發揮抗腦卒中的作用。circRNA 通常被用作miRNA 的分子海綿來調節mRNA 表達。研究發現，miR-367-3p具有明顯的抗IS 的作用[20]。本研究結果顯示，miR-367-3p為circ-TLK1的靶miRNA，circ-TLK1可以負向調節miR-367-3p表達；模型組SK-N-SH 細胞miR-367-3pmRNA 表達水平明顯降低，葛根素顯著上調miR-367-3pmRNA 表達，抑制miR-367-3p能夠逆轉葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用，表明葛根素可能通過下調circ-TLK1表達并上調miR-367-3p表達，從而發揮抗腦卒中的作用。

本研究通過生物信息學軟件搜索miR-367-3p的靶基因，并將TLR4 確認為miR-367-3p的直接靶點。miR-497能夠通過調節TLR4 和環磷腺苷反應元件結合蛋白（cAMP-responsive element-binding protein，CREB）信號傳導途徑減輕患者腦梗死[21]。miR-182-5p通過調節TLR4 介導的炎性反應，在腦缺血再灌注損傷中發揮神經保護作用[22]。本研究結果顯示，模型組TLR4 蛋白表達水平顯著降低，葛根素上調TLR4 蛋白表達，過表達TLR4能夠逆轉葛根素對OGD 致SK-N-SH 細胞損傷的保護作用；此外，circ-TLK1能夠通過結合miR-367-3p來調節TLR4 蛋白表達。以上結果表明，葛根素通過circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 軸抑制IS 中的神經細胞損傷。

綜上，葛根素能夠有效提高IS 體外模型中SK-N-SH 細胞存活率，抑制細胞凋亡，減少炎性因子的分泌，對神經細胞損傷具有保護作用，其作用機制與調控circ-TLK1/miR-367-3p/TLR4 有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突