化瘀通絡中藥對糖尿病腎病大鼠腎臟和AMPK/Nox4信號通路的作用研究

李雅純，方 敬，楊 帆，郭 帥，陳志強,

1.河北中醫學院，河北 石家莊 050000

2.河北省中醫院，河北 石家莊 050000

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是導致慢性腎功能衰竭的主要原因之一，為腎臟透析和移植的主要適應證[1-2]。中醫藥對改善DN 臨床癥狀、提高患者生存質量有良好效果。課題組以中醫理論為基礎并結合多年臨床實踐，認為瘀血阻絡證是貫穿DN 病程始終的獨立病機[3-4]。化瘀通絡中藥為臨床治療DN 的復方中必不可少的一部分，課題組前期研究發現，化瘀通絡中藥配伍應用能夠顯著降低DN 大鼠尿蛋白，延緩腎臟病理損傷[5-7]。

氧化應激在DN的疾病進展中起著重要作用[8]。過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）通過促進細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的積累參與DN 的發病，最終導致腎臟纖維化[1]。ROS 主要由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ nicotinamideadenine dinucleotide phosphate ，NADPH）氧化酶介導產生[9]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）能夠抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4，Nox4）過表達[10]，改善高脂飲食和糖尿病引起的氧化應激[11-12]，抑制轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）介導的纖維化[13]。因此，本研究探究化瘀通絡中藥能否通過作用于AMPK/Nox4信號通路，從而抑制DN 大鼠氧化應激、延緩腎臟纖維化。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，體質量60～80 g，21～34日齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。動物飼養于溫度23～25 ℃、濕度50%～70%的環境中，自由進食飲水。動物實驗經河北中醫學院倫理委員會批準（批準號DWLL2015002）。

1.2 藥品與試劑

化瘀通絡中藥配方顆粒由丹參（批號8080971）、川芎（批號8122561）、地龍（批號7125701）、水蛭（批號8081351）和全蝎（批號8050111）組成，均由廣東一方制藥有限公司惠贈；厄貝沙坦分散片（150 mg/片，批號1904238）購自華潤雙鶴利民藥業有限公司；鏈脲佐菌素（批號07171414）購自瑞士Alexis公司；丙二醛檢測試劑盒（批號A003-1-2）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號A001-3-2）購自南京建成生物研究所；Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（批號G3321）、引物、HRP 標記的山羊抗兔抗體（批號GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；AMPKα 抗體（批號5831）、磷酸化AMPKα（p-AMPKα）抗體（批號2535）購自美國CST 公司；Nox4 抗體（批號133303）、TGF-β1 抗體（批號215715）和纖維連接蛋白（fibronectin，FN）抗體（批號89443）購自英國Abcam 公司；8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）抗體（批號MOG-020P）購自日本老化制御研究所；β-actin 小鼠單克隆抗體（批號AF0003）購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 儀器

BX63 ＋DP72 正置研究級顯微鏡（日本Olympus 公司）；NanoDrop 2000C 紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Stepone plus熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；Infinite 200 多功能酶標儀（瑞士Tecan 公司）；LI-COR 紅外激光掃描儀（美國Odyssey 公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

40 只雄性SD 大鼠給予普通飼料適應性喂養1周，檢測其血糖和尿蛋白均為陰性。隨機選取7 只SD 大鼠作為對照組，予以普通飼料喂養；其余大鼠用高糖高脂飼料喂養6 周后，ip 鏈脲佐菌素溶液，（35 mg/kg），72 h 后尾靜脈取血3 次，檢測大鼠隨機血糖均≥16.7 mmol/L，DN 模型制備成功。2 只大鼠血糖不達標予以剔除，3 只大鼠ip 鏈脲佐菌素溶液72 h 內死亡。DN 大鼠隨機分為模型組、化瘀通絡中藥（4.41 g/kg）組和厄貝沙坦（13.5 mg/kg）組。化瘀通絡中藥組丹參、川芎、地龍、水蛭、全蝎劑量分別為1.35、1.08、0.9、0.54、0.54 g/kg（以中藥飲片量計），相當于臨床等效劑量，以上5 種顆粒按劑量配比混勻，溶于純凈水配制成質量濃度為0.49 g/mL 的溶液；厄貝沙坦分散片溶于純凈水配制成質量濃度為1.5 mg/mL 的混懸液。各給藥組ig 相應藥物（9 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積純凈水，1 次/d，連續16 周。

2.2 化瘀通絡中藥對DN 大鼠24 h 尿蛋白（urine total protein，UTP）和8-OHdG 水平的影響

給藥結束后，大鼠置于代謝籠中，收集24 h 尿液，測量尿量，混勻并留取1 mL，終點法檢測UTP和8-OHdG 水平。

2.3 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織病理變化的影響

大鼠脫頸椎處死，取腎組織于福爾馬林-醋酸-酒精（FAA）固定液中固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋后切片，進行PAS 和Masson染色，于顯微鏡下觀察腎組織病理變化，并采用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件對Masson 染色的病理切片進行分析，計算膠原面積。

2.4 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平的影響

取各組大鼠腎組織勻漿，按試劑盒說明書檢測各組大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平。

2.5 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織8-OHdG 和FN 蛋白表達的影響

取各組大鼠腎組織石蠟切片，使用微波進行抗原修復，加入3% H2O2用來阻斷內源性過氧化物酶，滴加血清封閉，加入8-OHdG、FN 抗體（1∶200）孵育過夜，滴加HRP 標記的山羊抗兔抗體，使用DAB 顯色、復染后封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.6 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織TGF-β1 mRNA 表達的影響

按照試劑盒說明書提取各組大鼠腎組織總RNA 并合成cDNA，進行qRT-PCR 分析。引物序列：TGF-β1上游引物5’-ATGGTGGACCGCAAC- AAC-3’，下游引物5’-TGAGCACTGAAGCGAA- AGC-3’；GAPDH上游引物5’-CTGGAGAAACCTG- CCAAGTATG-3’，下游引物5’-GGTGGAAGAATG- GGAGTTGCT-3’。

2.7 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織AMPKα、p-AMPKα、Nox4 和TGF-β1 蛋白表達的影響

取各組大鼠腎組織，加入RIPA 裂解液勻漿，提取總蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，加入脫脂牛奶于室溫封閉，分別加入AMPKα 抗體（1∶800）、p-AMPKα抗體（1∶1000）、Nox4 抗體（1∶1000）、TGF-β1抗體（1∶600）和β-actin 抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入HRP 標記的山羊抗兔抗體（1∶3000），室溫孵育30 min，加入ECL 試劑顯影，采用Quantity one 軟件分析目標條帶的灰度值。

2.8 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學處理，數據以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA。

3 結果

3.1 各組大鼠的一般情況

對照組大鼠活潑靈敏，模型組和各給藥組大鼠精神萎靡、反應遲鈍，其中模型組大鼠表現最為明顯。給藥過程中，模型組死亡3 只大鼠，化瘀通絡中藥組和厄貝沙坦組各死亡2 只大鼠。

3.2 化瘀通絡中藥對DN 大鼠24 h UTP 的影響

如表1 所示，與對照組比較，模型組大鼠24 h UTP 明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠24 h UTP 顯著降低（P＜0.05、0.01）。

表1 化瘀通絡中藥對DN 大鼠24 h UTP 水平的影響 (± s, n = 7)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on 24 h UTP of DN rats (± s, n = 7)

表1 化瘀通絡中藥對DN 大鼠24 h UTP 水平的影響 (± s, n = 7)Table 1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on 24 h UTP of DN rats (± s, n = 7)

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下表同##P< 0.05 ##P< 0.01 vs control group; *P< 0.05 **P< 0.01 vs model group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg-1) 24 h UTP/mg 對照 — 04.53±2.08 模型 — 35.54±4.05## 化瘀通絡中藥 4.41 29.06±4.29* 厄貝沙坦 0.0135 30.71±4.08**

3.3 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1 所示，對照組大鼠腎臟結構清晰；模型組大鼠腎小球肥大、囊腔變窄，部分出現球囊粘連，腎小球基底膜明顯增厚，系膜基質重度增生，小管間質ECM 明顯沉積；各給藥組大鼠腎臟病理損傷均有不同程度好轉，且腎組織ECM 堆積減少。與對照組比較，模型組大鼠腎組織膠原面積占比明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織膠原面積占比明顯降低（P＜0.01）。

圖1 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織病理變化的影響Fig .1 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on pathological changes of rat kidney in DN rats

3.4 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織SOD 活性明顯下降（P＜0.01），丙二醛水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，化瘀通絡中藥組大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平明顯升高（P＜0.05、0.01），厄貝沙坦組大鼠腎組織SOD 活性明顯降低（P＜0.05）。

3.5 化瘀通絡中藥對DN大鼠腎組織8-OHdG蛋白表達和尿液8-OHdG 水平的影響

8-OHdG 是DNA 的一種氧化嘌呤殘基，是氧化性組織損傷的標記物[14]。糖尿病患者尿液中8-OHdG 水平與DN 疾病進展密切相關[15]。如圖2所示，8-OHdG 主要在腎小球和小管的細胞核表達，與對照組比較，模型組大鼠腎組織8-OHdG 表達增加，尿液8-OHdG 水平明顯增多（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織8-OHdG 表達減少，尿液8-OHdG 水平顯著降低（P＜0.05、0.01）。

3.6 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織FN 蛋白表達的影響

如圖3 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織FN 表達增加；與模型組比較，各給藥組大鼠腎組織FN 表達減少。

表2 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平的影響 (± s, n = 7)Table 2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on SOD activity and malondialdehyde level of rat kidney in DN rats (± s, n = 7)

表2 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織SOD 活性和丙二醛水平的影響 (± s, n = 7)Table 2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on SOD activity and malondialdehyde level of rat kidney in DN rats (± s, n = 7)

組別 劑量/(g·kg-1) SOD 活性/(U·mg-1) 丙二醛水平/(nmol·mg-1) 對照 — 528.98±32.71 0.82±0.23 模型 — 423.96±39.93## 2.25±0.36## 化瘀通絡中藥 4.41 468.51±34.87* 1.54±0.36** 厄貝沙坦 0.0135 475.44±47.11* 1.91±0.32

圖2 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織8-OHdG 蛋白表達和尿液8-OHdG 水平的影響Fig.2 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on 8-OHdG expression in kidney and 8-OHdG level in urine of DN rats

圖3 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織FN 蛋白表達的影響 (×400)Fig.3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on FN expression in kidney of DN rats (× 400)

3.7 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織TGF-β1 mRNA 和蛋白表達的影響

如圖4 和表3 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1mRNA 和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組腎組織TGF-β1mRNA 和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05、0.01）。

圖4 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織TGF-β1 蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 expression in kidney of DN rats

表3 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織TGF-β1 mRNA 和蛋白表達的影響 (± s, n = 7)Table 3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 mRNA and protein expression in kidney of DN rats (± s, n = 7)

表3 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織TGF-β1 mRNA 和蛋白表達的影響 (± s, n = 7)Table 3 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on TGF-β1 mRNA and protein expression in kidney of DN rats (± s, n = 7)

組別 劑量/(g·kg-1) TGF-β1 mRNA 相對表達量 TGF-β1 蛋白相對表達量 對照 — 1.01±0.13 0.530±0.025 模型 — 1.66±0.08## 0.829±0.039## 化瘀通絡中藥 4.41 1.31±0.20* 0.687±0.052** 厄貝沙坦 0.0135 1.38±0.08* 0.605±0.054**

3.8 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織AMPKα、p-AMPKα 和Nox4 蛋白表達的影響

如圖5 和表4 所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織p-AMPKα/AMPKα 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），Nox4 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組p-AMPKα/AMPKα蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），Nox4 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織AMPKα、p-AMPKα和Nox4 蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on AMPKα, p-AMPKα and Nox4 expression in kidney of DN rats

4 討論

表4 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織AMPKα、p-AMPKα 和Nox4 蛋白表達的影響 (± s, n = 7)Table 4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on AMPKα, p-AMPKα, and Nox4 expression in kidney of DN rats (± s, n = 7)

表4 化瘀通絡中藥對DN 大鼠腎組織AMPKα、p-AMPKα 和Nox4 蛋白表達的影響 (± s, n = 7)Table 4 Effect of Huayu Tongluo Chinese medicines on AMPKα, p-AMPKα, and Nox4 expression in kidney of DN rats (± s, n = 7)

組別 劑量/(g·kg-1) p-AMPKα/AMPKα蛋 白相對表達量 Nox4 對照 — 0.672±0.068 0.473±0.054 ###模型 — 0.507±0.072 0.740±0.044 化瘀通絡中藥 4.41 0.641±0.055* 0.614±0.076* 厄貝沙坦 0.0135 0.654±0.066* 0.569±0.085*

本研究采用高糖高脂飼料喂養聯合ip 鏈脲佐菌素溶液建立DN 模型，發現造模大鼠血糖升高，并出現了UTP 升高和腎臟病理損傷。目前針對DN的現代醫學治療手段主要為嚴格控制血糖與血壓。厄貝沙坦作為血管緊張素受體拮抗劑類的降壓藥物，大量臨床隨機對照試驗表明厄貝沙坦具有腎臟保護作用，能夠減少早期和中晚期DN 患者UTP，延緩腎臟病變[16-17]。因此，本研究選用厄貝沙坦作為陽性對照藥物，研究化瘀通絡中藥對DN 大鼠的保護作用。DN 作為糖尿病的嚴重微血管并發癥，其主要臨床表現為大量蛋白尿，主要病理表現為ECM 增生，ECM 積聚導致腎小球和腎小管基底膜增厚，最終發展為腎小球硬化和小管間質纖維化。TGF-β1 是糖尿病中導致腎臟ECM 積累的關鍵細胞因子[18]，過度表達的TGF-β1 使ECM 如I、III、IV型膠原及FN 和層黏連蛋白（laminin，LN）等大量積聚，同時刺激蛋白酶抑制劑、纖溶酶原活化抑制劑合成，使ECM 降解減少，最終導致腎臟纖維化[19-20]。研究發現，由于ROS 產生過多引起的腎臟氧化應激是導致TGF-β1 高表達和ECM增生的主要原因之一[21]；由Nox4 衍生的ROS 為引起糖尿病早期階段氧化應激的主要原因，能夠導致糖尿病腎臟肥大和ECM 表達增加[22]；在高糖環境下暴露的系膜細胞和小管細胞中，Nox4 的上調與TGF-β1、FN的升高有關[23]。

AMPK 為細胞的能量傳感器，負責調節并維持機體的糖脂代謝和能量代謝平衡[24]。AMPK 作為與肥胖、糖尿病和代謝綜合征相關疾病的治療靶點，受到廣泛關注[25]。研究發現，糖尿病小鼠腎臟中AMPK 表達降低，DN 患者腎組織p-AMPK 蛋白表達明顯減少；AMPK 激活劑可以改善DN 相關的臨床與病理改變，降低UTP，下調TGF-β1 表達，減少ECM 積聚，從而改善DN 腎臟纖維化[12]。AMPK不僅是細胞的主能量傳感器，也是細胞內的主ROS傳感器[26]。AMPK 激活后可以阻斷Nox4，減少ROS生成，降低UTP 排泄和基質蛋白表達[27-28]。AMPK是1 種異源三聚體蛋白，由催化亞基α 和調節亞基β、γ 組成，其中α 亞基在哺乳動物腎臟中廣泛表達，且AMPK 的激活需要α 亞基上的蘇氨酸殘基（Thr 172）參與[29]。因此，本研究通過檢測大鼠腎組織AMPKα 和Nox4 蛋白表達情況，來評估AMPK/ Nox4 信號通路對DN 腎臟纖維化的影響。

糖尿病屬于中醫消渴的范疇，其基本病機為氣陰兩虛、消渴日久、氣虛無力推動血行而致瘀；陰虛生熱、熱灼津液、津虧血少、脈道充養不足同樣致瘀，瘀血不僅是病理產物，同時也是致病因素，其阻于腎絡，發為DN。因此，課題組認為瘀血阻絡是DN 的基本病機。現代藥理學研究表明ECM增生作為DN 的主要病理改變與血瘀證有明顯的相關性[30]，經過化瘀通絡治療可以顯著降低腎絡瘀阻患者血清TGF-βl、LN 和IV 型膠原水平[31]。課題組前期研究表明，化瘀通絡中藥可以明顯改善DN大鼠的腎臟病理表現，下調ECM 蛋白表達，延緩腎臟纖維化[32-33]。化瘀通絡中藥可以改善DN 患者臨床癥狀，且療效可靠[34-35]。活血化瘀類中藥復方制劑—丹參川芎嗪注射液可以明顯改善血液流變學異常[36]；消癥通絡類中藥—地龍與水蛭合用具有改善微循環、增加腎血流量、促進纖維蛋白溶解、抑制血小板聚集的作用[37]；全蝎可以促進纖溶系統的激活，從而抗栓、溶栓[38]。因此，本研究選用活血化瘀之草本代表藥物丹參、川芎和消癥通絡之蟲類代表藥物地龍、水蛭、全蝎，5 藥合用，共奏化瘀通絡之功。本研究結果顯示，化瘀通絡中藥能夠明顯降低DN 大鼠的UTP，下調TGF-β1 和FN 的表達，減少ECM 堆積，延緩腎臟纖維化進程；增加SOD 活性，減少丙二醛水平，降低尿液8-OHdG排泄及其腎臟表達，抑制氧化應激；上調p-AMPKα蛋白表達水平，下調Nox4 蛋白表達水平。

綜上所述，AMPK/Nox4 信號通路可能是化瘀通絡中藥減輕腎臟氧化損傷、減少ECM 增生、延緩腎臟纖維化、保護DN 腎臟的作用靶點之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突