一測多評法同時測定蒙藥扎沖十三味丸中8種成分

寶魯爾，王 徽，吳杰斯，白塔那，陳紅梅，王秀蘭*

1.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古 通遼 028000

2.內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000

扎沖十三味丸（Zhachong Shisanwei Pills，ZSP）又名嘎日迪十三味丸、十三味麝香丸、十三味大鵬金翅丸、扎沖朱素木，在蒙醫臨床上使用歷史較長，此方由木香、訶子、甘草、麝香、肉豆蔻、制草烏、石菖蒲、丁香、沉香、珍珠（制）、磁石（煅）、禹糧土、珊瑚（制）共13 味單藥組成，具有除“協日烏素”、鎮靜安神、祛風通竅、舒筋活血功效，用于左痰右瘓、手腳麻痹、腰腿不利、言語不清、口眼歪斜、神經麻痹、半身不遂、筋骨疼痛、關節疼痛、風濕[1]。臨床上用于治療缺血性腦血管?。ò酌}病）、風濕性關節炎（協日烏素?。?、面肌痙攣、周圍性神經麻痹、坐骨神經痛、冠心病心絞痛等疾病[2-4]。

蒙藥是蒙古族歷代蒙醫經典醫籍傳承的寶貴財富，具有獨特的功效。近幾年研究蒙藥復方的學者和研究人員逐漸增多，同時，為了順應國際和國內的用藥需求，對蒙藥復方的質量控制也不再是單一成分的含量測定，而通過對多成分同時測定實現蒙藥復方的多指標質量評價。一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）是一種采用1 個成分來實現對多個成分同步監控的有效方法，近年來在蒙藥復方制劑多指標成分定量測定中得到廣泛應用。本實驗采用QAMS法同時測定ZSP中主要活性成分沒食子酸、鞣花酸、綠原酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨、沉香四醇的含量，為蒙藥ZSP 的多指標質量控制提供實驗依據和參考方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity II 型高效液相，美國Agilent科技有限公司；Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BDS HypersilTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；島津LC-20A（20A）型高效液相，日本島津科技有限公司；QUINTIX35-1CN 型十萬分之一電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-300VDY 型醫用超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 材料

ZSP，9 個批次，批號1908003、1908005、1908008、1909010、1909011、1909016、1911004、1911005、1911006，內蒙古奧特奇蒙藥股份有限公司。對照品沒食子酸（批號110831-201605，質量分數90.8%）、綠原酸（批號110753-200413，質量分數99.3%）、鞣花酸（批號111959-201903，質量分數88.8%）、沉香四醇（批號111980-201904，質量分數98.6%）、丁香酚（批號110725-201917，質量分數99.1%）、甘草酸銨（批號110731-201619，質量分數93.0%）、α-細辛腦（批號100298-201203，質量分數100.0%）、β-細辛醚（批號112018-201802，質量分數99.3%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC 定量方法

2.1.1 色譜條件 Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～7 min，30%甲醇；7～20 min，30%～51%甲醇；20～28 min，51%～59%甲醇；28～55 min，59%～75%甲醇；檢測波長為0～7 min，271 nm（沒食子酸）；7～20 min，252 nm（綠原酸、沉香四醇）；20～28 min，254 nm（鞣花酸）；28～33 min，281 nm（丁香酚）；33～45 min，257 nm（β-細辛醚、α-細辛腦）；45～55 min，237 nm（甘草酸銨）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量7 μL。該色譜條件下對照品及樣品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品 (A) 和ZSP 樣品 (B) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and ZSP sample (B)

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密量取沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨對照品儲備液適量，混合均勻，加甲醇進行稀釋，制成含沒食子酸0.184 mg/mL、綠原酸0.116 mg/mL、沉香四醇0.167 mg/mL、鞣花酸0.063 mg/mL、丁香酚0.207 mg/mL、β-細辛醚0.042 mg/mL、α-細辛腦0.025 mg/mL、甘草酸銨0.094 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取樣品2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱定 質量，超聲35 min，放冷至室溫，甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液經0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.4 線性關系考察 將“2.1.2”項下混合對照品溶液按照“2.1.1”項下色譜條件分別進樣0.5、2.0、3.5、5.0、6.5、8.0 μL，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量為橫坐標（X）進行線性回歸，各組分的回歸方程及相關系數見表1?？梢娫摲椒ㄔ谠囼灧秶鷥染€性關系良好。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液，以“2.1.1”項下色譜條件重復進樣6 次，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.40%、0.73%、0.35%、0.51%、0.93%、0.79%、1.81%、1.69%，表明在該條件下儀器精密度良好。

表1 線性關系測定結果Table 1 Results of determination of linearity relation

2.1.6 穩定性試驗 取ZSP 粉末2.0 g，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 按照“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.14%、1.08%、0.22%、0.08%、0.72%、0.47%、1.84%、1.71%，表明該供試品溶液在室溫下24 h 內穩定。

2.1.7 重復性試驗 取同一批次ZSP 粉末（批號1908003）2.0 g，精密稱定，按照“2.1.3”項下方法制備6 份供試品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣，計算沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨峰面積的RSD 值分別為0.06%、1.03%、0.19%、0.12%、0.29%、0.57%、1.86%、1.54%，表明該方法重復性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取同一批次ZSP 粉末（批號1908003）共6 份，每份1.0 g，精密稱定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密量取質量濃度為 1.66 mg/mL 沒食子酸、0.52 mg/mL 綠原酸、0.97 mg/mL沉香四醇、0.67 mg/mL 鞣花酸、1.74 mg/mL 丁香酚、0.29 mg/mL β-細辛醚、0.26 mg/mL α-細辛腦、0.56 mg/mL 甘草酸銨的混合對照品溶液1 mL，再按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算8 種成分的加樣回收率以及RSD 值，結果顯示，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為 94.49%、100.43%、91.90%、94.66%、99.82%、95.85%、99.66%、97.34%，RSD 值分別為0.45%、0.42%、0.26%、0.64%、0.60%、1.37%、0.78%、1.95%，表明該方法具有良好的回收率。

2.2 相對校正因子（fs/i）的確定及耐用性考察

2.2.1fs/i的測定 取“2.1.2”項下混合對照品溶液進樣分析，記錄各成分的峰面積，以丁香酚為內參物，取多個質量點計算所得的fs/i，取平均值作為定量用fs/i［fs/i＝fs/fi＝AsCi/AiCs，其中As為丁香酚對照品的峰面積，Cs為丁香酚對照品的質量濃度，Ai為待測成分的峰面積，Ci為待測成分的質量濃度］[5-7]。計算待測組分沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的fs/i，結果見表2。結果顯示，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨與內參物丁香酚之間的fs/i分別為0.433 4、1.068 3、0.505 6、0.141 6、0.429 0、0.346 2、1.748 8，RSD 值分別為0.77%、0.40%、0.90%、0.82%、0.61%、1.42%、1.69%。

2.2.2 不同色譜儀器和色譜柱對fs/i的影響 本實驗考察了Agilent 1260 高效液相色譜儀器（美國）和LC-20A（20A）高效液相色譜儀（日本島津）對fs/i的影響，Agilent Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Inertsil ODS-3 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、BDS HypersilTMC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對fs/i的影響，結果見表3。結果顯示，2 臺色譜儀器和3 根色譜柱測得各待測成分fs/i的RSD均小于2.0%，表明fs/i在不同色譜儀器和色譜柱下具有良好的耐用性。

2.2.3 不同柱溫對fs/i的影響 本實驗考察了不同柱溫（25、30、35、40 ℃）對fs/i的影響，結果見表4。結果顯示，在不同柱溫測得各待測成分fs/i的RSD 均小于2%，表明fs/i在柱溫有波動時具有良好的耐用性。

表2 ZSP 中7 種成分的fs/iTable 2 fs/i of seven components for ZSP

表3 不同色譜儀器和色譜柱對fs/i 的影響Table 3 Effects of different instruments and columns on fs/i

表4 不同柱溫對fs/i 的影響Table 4 Effects of different column temperatures on fs/i

2.2.4 不同體積流量對fs/i的影響 本試驗考察了不同體積流量（0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min）對fs/i的影響，結果見表5。結果顯示，在不同體積流量測得各待測成分fs/i的RSD 均小于2%，表明fs/i在體積流量有變化時具有良好的耐用性。

2.3 待測組分色譜峰定位

文獻對色譜峰的定位普遍采用相對保留時間和保留時間差來定位峰[8-11]。取混合對照品溶液，選取2 臺色譜儀器和3 根不同型號色譜柱，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，以丁香酚為參照峰，計算其他7 種成分的相對保留時間（ti/s）和保留時間差（Δti/s）。結果見表6、7。

s 為內參物，i為待測組分，t為保留時間

表6 的結果顯示，在相同色譜條件下，當色譜柱發生變化時，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸相對保留時間的RSD 值均大于5%，表明不能用相對保留時間定位色譜峰。

表7 的結果顯示，在相同色譜條件下，沒食子酸、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的保留時間差相差較大，其RSD 值均大于5%，表明不能用保留時間差定位色譜峰。

表5 體積流量對fs/i 的影響Table 5 Effects of volume flow rate on fs/i

表6 不同色譜柱測得的ti/sTable 6 ti/s of different columns

表7 不同色譜柱測得的Δti/sTable 7 Difference of retention time measured by different chromatographic columns

本實驗進一步采用兩點校正法[12-13]定位色譜峰。精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液7 μL，以確定的色譜條件分別在3 根色譜柱上測定，分別得到沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的保留時間，以Agilent 1260 儀器和Inertsil ODS-3 色譜柱為標準儀器和標準色譜柱，以此儀器和色譜柱測定的沒食子酸和甘草酸銨的保留時間為橫坐標（x），其他儀器和色譜柱測定的沒食子酸和甘草酸銨的保留時間為縱坐標（y），分別建立線性方程，再將標準儀器和標準色譜柱上的綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦的保留時間為自變量，分別代入各對應色譜柱線性方程中，求得綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦在相應的各色譜柱上的理論預測保留時間，將計算得到的各待測組分理論預測保留時間與該組分在相應柱上實測的保留時間差為絕對誤差（absolute error，AE，AE＝測量值－真實值），結果見表8。結果顯示，在色譜條件相同，色譜儀器和色譜柱不同時，沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的實測保留時間與理論預測保留時間的差值較小，故本實驗用兩點校正法來定位色譜峰。

表8 不同儀器和色譜柱時預測出峰時間Table 8 Peak time with different instruments and different chromatographic columns

2.4 QAMS 法與外標法結果對比

取2.0 g ZSP 樣品粉末，精密稱定9 份，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄峰面積，采用QAMS 法建立內參物丁香酚與沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的相對校正因子，對9 個批號ZSP 樣品中各成分含量進行計算，同時采用外標法對沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨成分進行含量測定，并以相對誤差（relative error，RE）為參數對2 種方法所得結果進行比較[14]，結果見表9。結果顯示，QAMS 法與外標法所測定結果之間差異的RE 均小于5%，表明2 種方法測之間差異較小，所以本實驗之前建立的fs/i準確可靠，可以用于測定蒙藥ZSP 中沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的含量。

3 討論

3.1 蒙藥ZSP 測定指標成分的選定

蒙藥ZSP含量測定指標及其測定方法文獻已有報道，但所選擇的測定指標均為一種藥材中的一種或者多種指標。本研究建立了多種藥材中的多指標成分測定方法，采用高效液相色譜法同時測定了沒食子酸、綠原酸、沉香四醇、鞣花酸、丁香酚、β-細辛醚、α-細辛腦、甘草酸銨的含量，用以表征蒙藥ZSP 的質量，能更加全面地反映安全質量。

3.2 供試品制備條件的選定

本實驗考察了提取溶劑（甲醇、75%甲醇、乙腈），超聲時間（25、35、45 min），以所測8 個成分的提取效率為指標，最終確定ZSP 供試品溶液的制備方法為以甲醇為提取溶劑、超聲提取時間為35 min，過濾紙過濾方法來處理供試品。

表9 QAMS 法與外標法測得9 批ZSP 中8 種成分的質量分數 (n = 9)Table 9 Content of four constituents in three batches of ZSP by QAMS and external reference method (n = 9)

3.3 色譜條件的選定

在流動相條件摸索中，考察了甲醇-水、甲醇- 0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、甲醇- 0.1%磷酸水溶液流動相體系，以ZSP 中所測8 種成分的分離效果為指標，最終確定以甲醇為流動相C、以0.1%磷酸水溶液為流動相D，考察不同體積流量（0.8、1.0、1.2、1.4 mL/min）、不同柱溫（25、30、35、40 ℃）、不同進樣量（5、7、10、15、20 μL），在保證各色譜峰分離度的前提下，盡量縮短分析時間，確定最終條件為甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量7 μL。

3.4 檢測波長的選定

蒙藥復方制劑所含成分復雜，各成分的最大吸收波長不同，當采用某一個固定波長時，難以確保所測出各成分的靈敏度和精密度、獲得最大吸收，影響定量測定結果[15]。本實驗采用DAD 檢測器在190～400 nm 進行光譜掃描，對不同波長下檢測得的三維圖譜進行分析對比。結果顯示，沒食子酸的最大吸收波長為271 nm、綠原酸與沉香四醇的最大吸收波長為252 nm、鞣花酸的最大吸收波長為254 nm、丁香酚的最大吸收波長為281 nm、β-細辛醚與α-細辛腦的最大吸收波長為257 nm，甘草酸銨的最大吸收波長為237 nm。為了使各成分在同一色譜圖中均被采集，故采用VWD 檢測器切換波長法進行含量測定[16]。

3.5 內參物的選定

建立一測多評法中選定好內參物是很重要，選定內參物的標準是易得、價廉、有效者、峰面積和保留時間穩定、供試品中的含量高，故本實驗選定丁香酚為內參物[17]。

3.6 色譜峰定位法的選定

各待測成分色譜峰的準確定位是一測多評法成功應用的關鍵之一。根據文獻報道[18]，大多數采用相對保留時間和保留時間差法定位待測成分色譜峰。本實驗當中考察了相對保留時間法和保留時間差法、兩點校正法在不同廠家儀器和色譜柱中的重現性。實驗結果顯示，在不同色譜儀和不同色譜柱測得的各待測成分出峰時間有所不同，相對保留時間法和保留時間差法的RSD 均大于5%，故不適合對本實驗一測多評法色譜峰定位。采用兩點校正法進行定位色譜峰時，所得各待測成分色譜峰實測保留時間與預測保留時間差值較小，最終本實驗選定采用兩點校正法定位待測成分色譜峰。

本實驗建立QAMS 法同時測定ZSP（9 個批次）中8種成分的含量，對QAMS法的可行性進行探討，結果表明QAMS 法測得結果與外標法法測得結果沒有顯著差異，表明在對照品難以得到的情況下可以通過測定蒙藥ZSP中丁香酚的含量來計算出其他7 種成分的含量，實現多指標同步質量控制，反映蒙藥ZSP 的質量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突