基于離線2D-HPLC-DPPH-ESI-Q-TOF/MS聯(lián)用技術(shù)的金銀花抗氧化成分系統(tǒng)篩選研究

張敏敏 ，趙志國 ，劉 倩 ，劉 偉 ，王 曉 ，趙恒強(qiáng) *

1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院），山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014

2.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014

自由基是1 個含有不成對電子的原子團(tuán)，性質(zhì)極不穩(wěn)定。體內(nèi)過盛的自由基會攻擊人體細(xì)胞對人體造成嚴(yán)重?fù)p傷，維持體內(nèi)自由基平衡是保證人體健康的重要途徑。抗氧化劑是一類能幫助捕獲并中和自由基，從而祛除自由基對人體損害的一類物質(zhì)。具有自由基清除作用的抗氧化劑的研究已成熱點，其中天然抗氧化劑以其高安全性、強(qiáng)環(huán)保性等優(yōu)勢成為科學(xué)研究中的重要目標(biāo)[1-2]。天然抗氧化劑的發(fā)現(xiàn)也是天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域的重要研究方向。

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera j aponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開的花[3]，在我國傳統(tǒng)中藥處方中廣泛用于治療發(fā)燒、感染、瘡瘍和腫脹等疾病[4-5]，2002年被列入原衛(wèi)生部公布的《既是食品又是藥品的藥物名單》，成為藥食同源食品被廣泛應(yīng)用于保健食品和功能飲料行業(yè)[6-7]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花提取物具有解熱、保肝、抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒等廣泛的生物活性[8-11]。王春鵬等[12]建立了金銀花抗氧化活性指紋圖譜，從其中篩選出綠原酸和異綠原酸A 為主的8 個抗氧化成分；梁從蓮等[13]建立金銀花指紋圖譜及清除DPPH自由基的譜-效關(guān)系，由此可見，金銀花也是天然抗氧化劑的一個良好來源。研究發(fā)現(xiàn)，金銀花中含有酚酸類、黃酮類、環(huán)烯醚萜類等多種化學(xué)成分[14-16]，且各成分含量、極性差異較大，是復(fù)雜體系天然產(chǎn)物的代表。由于化學(xué)成分的復(fù)雜性對其提取物中抗氧化活性成分的發(fā)現(xiàn)造成了較大的干擾，尤其是對低含量化合物的活性發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用造成了較大困難。

傳統(tǒng)的天然產(chǎn)物活性成分發(fā)現(xiàn)方法一般是采用一系列的分離和純化技術(shù)得到單體成分，再進(jìn)行體內(nèi)或體外藥理學(xué)篩選，該方法在藥物開發(fā)中發(fā)揮著重要作用[17-19]。但是，該方法存在耗時、耗能、效率較低、較為盲目等不足。另外，某些化合物由于含量較低和分離純化過程中性質(zhì)不穩(wěn)定等因素使其抗氧化活性難以被發(fā)現(xiàn)。近年來，基于液相色譜-二苯基-三硝基-苯肼[high performance liquid chromatography-2,2-diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl，HPLC-DPPH] 技術(shù)的在線抗氧化成分篩選技術(shù)，具有色譜分離和活性篩選同時進(jìn)行，高效、快速等優(yōu)勢，目前已廣泛用于天然抗氧化活性成分的快速篩選[20-25]，成為天然產(chǎn)物中抗氧化成分篩選的主要方法之一。本課題組也應(yīng)用該技術(shù)進(jìn)行了木瓜、厚樸等多種天然產(chǎn)物中抗氧化成分的快速篩選[26-27]，取得了較好的結(jié)果。但綜合對比以往的研究可以發(fā)現(xiàn)，該方法對化學(xué)成分相對簡單，含量較高成分的篩選效果較好，但對復(fù)雜體系天然產(chǎn)物中極性差異大和含量較低活性成分的同時篩選仍然存在一定困難，制約了該技術(shù)在天然產(chǎn)物抗氧化成分篩選中的應(yīng)用。

離線二維色譜技術(shù)具有分辨率高、通量大、儀器配置要求低等優(yōu)點，結(jié)合高分辨飛行時間質(zhì)譜技術(shù)可以實現(xiàn)復(fù)雜體系天然產(chǎn)物中化學(xué)成分的分析表征。特別適合不同極性成分、結(jié)構(gòu)類似物的分析表征，并且可以實現(xiàn)低含量成分的富集。離線二維色譜技術(shù)與DPPH-HPLC 技術(shù)聯(lián)用將大大增加復(fù)雜體系天然產(chǎn)物中抗氧化成分的篩選能力，有關(guān)這方面的研究未見報道。

本研究提出了離線二維色譜聯(lián)合 DPPH- HPLC-ESI-Q-TOF/MS 技術(shù)的金銀花抗氧化成分的系統(tǒng)篩選方法。運用該方法從金銀花中篩選出36種具有抗氧化活性的化學(xué)成分。該研究為復(fù)雜體系天然產(chǎn)物中抗氧化成分的系統(tǒng)篩選研究提供方法和技術(shù)支持。

1 儀器與材料

賽默飛Unimates3000 系列高效液相色譜系統(tǒng)（美國賽默飛世尓科技公司）；高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。Tecan M20 系列多功能酶標(biāo)儀（瑞士帝肯集團(tuán)有限公司）；布魯克 IMPACT II ESI-Q-TOF/MS 質(zhì)譜儀（美國布魯克公司）；MICROTESTTM96 孔酶標(biāo)板（波士頓狄金森公司）；SB-5200D 系列高功率超聲波清洗儀（寧波新芝公司）；CPA225D 型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購買于Sigma公司，乙腈（色譜純）購于Merch 公司；對照品新綠原酸（批號 M07GB140938）、綠原酸（批號Y24J7K16726）、隱綠原酸（批號M06GB147634）、蘆?。ㄅ?A05GB144263）、木犀草苷（批號Y13J10H93050）、異綠原酸(批號AP11D11L134209）、異綠原酸（批號BP17N11L131404）、異綠原酸C（批號M11GB140940）、1,3-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ朠22J11F116507）均購于上海源葉生物技術(shù)公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水（Millipore Q-Plus 系統(tǒng)，美國）。

金銀花樣品購于濟(jì)南漱玉平民大藥房，經(jīng)齊魯工業(yè)大學(xué)（山東科學(xué)院山東省分析測試中心）王曉教授鑒定為忍冬科植物忍冬L.japonicaThunb.的干燥花蕾。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

2.1.1 待測樣品 精密稱定金銀花粉末10 g，加入70%甲醇1000 mL，超聲提取30 min，減壓蒸干后用20 mL 70%甲醇復(fù)溶，過0.45 微孔濾膜，備用。

2.1.2 篩選試劑 精密稱定DPPH，用80%乙腈配制成濃度為60 μmol/L 的DPPH 自由基溶液，置于4 ℃保存。

2.1.3 對照品溶液 分別精密稱定各對照品1.0 mg于1 mL 量瓶中，溶解后用甲醇定容，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的對照品溶液。

2.2 色譜條件

2.2.1 一維色譜條件 采用RIGOL-3245 半制備液相色譜系統(tǒng)結(jié)合反相制備色譜柱對金銀花粗提物進(jìn)行初步分段制備。色譜柱：YMC-Pack ODS-A柱（250 mm×10.0 mm，5 μm）；流動相：0.2%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）。梯度洗脫：0～20 min，10%～40% B；20～30 min，40%～50% B；30～31 min，50%～100% B。體積流量3.0 mL/min，檢測波長為280 nm。進(jìn)樣量為100 μL。3 部分流分（流分A～C）收集后冷凍干燥，用70%甲醇復(fù)溶，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過后用于后續(xù)分析、鑒定和篩選。

2.2.2 二維色譜條件 采用賽默飛U3000超高效液相色譜系統(tǒng)完成樣品的分段分析。鑒于組分間極性和含量的差異，需針對3 個流分分別優(yōu)化出不同的液相分離條件和質(zhì)譜鑒別條件，以獲得更多的色譜分離峰和較好的分離效果。

（1）流分A 色譜分析：沃特世XBridge Amide色譜柱（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：水（含0.8%甲酸、10 mmol/L 甲酸銨，A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～5 min，96%～93% B；5～20 min，93% B；20～30 min，93%～85% B；30～40 min，85%～82% B；40～50 min，82%～78% B；50～51 min，78%～50% B；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；柱溫35 ℃。

（2）流分B 色譜分析：安捷倫Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；流動相：水（含0.6%甲酸，A）-乙腈（含10%水，B）；梯度洗脫：0～5 min，5%～6% B；5～15 min，6%～8% B；15～25 min，8%～10% B；25～40 min，10%～13% B；40～45 min，13%～15% B；45～55 min，15%～17% B；55～65 min，17%～30% B；65～70 min，30%～45% B；體積流量0.5 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫35 ℃。

（3）流分C 色譜分析：沃特世Xselect HSS T3色譜柱（150 mm×3.0 mm，3.5 μm）；流動相：水（含0.8%甲酸、10 mmol/L 甲酸銨，A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～10 min，14%～17% B；10～20 min，17%～18% B；20～30 min，18%～19% B；30～50 min，19%～23% B；50～65 min，23%～28% B；65～75 min，28%～35% B；體積流量0.5 mL/min；檢測波長345 nm；柱溫40 ℃。

2.3 在線抗氧化篩選

利用賽默飛U3000雙三元液相色譜系統(tǒng)完成各組分在線抗氧化篩選。各流分利用右泵經(jīng)最優(yōu)化的色譜條件進(jìn)樣分析，樣品經(jīng)過色譜柱分離后與左泵泵出的DPPH 溶液混合，混合液在反應(yīng)池中反應(yīng)后流入HPLC 系統(tǒng)的DAD 檢測器進(jìn)行檢測。鑒于DPPH 在波長517 nm 處的特征峰由于DPPH 自由基被抗氧化活性成分清除后會形成倒峰。對比樣品最佳吸收波長下和DPPH 自由基特征波長下的HPLC圖譜確定篩選出抗氧化活性成分。

2.4 ESI-Q-TOF/MS 分析

電噴霧正負(fù)離子全掃描檢測；全掃描范圍m/z50～1500；錐孔電壓60 V；毛細(xì)管電壓5.0 kV；裂解電壓120 V；噴霧氣壓310 kPa；干燥氣體積流量8.0 L/min；干燥氣溫度200 ℃，通過以上質(zhì)譜條件對這3 組流分分別進(jìn)行質(zhì)譜鑒別分析。

2.5 活性驗證

將各單一對照品儲備液分別稀釋至7 個不同的質(zhì)量濃度（0.50、0.25、0.10、0.05、0.02、0.01、0.005 mg/mL），作為待測樣品備用。

取待測溶液50 μL，0.04 mg/mL DPPH 溶液100 μL 加入到96 孔板中混勻，室溫避光孵育30 min 后在酶標(biāo)儀517 nm 下測定吸光度（A）值。對照組中以50 μL 甲醇代替50 μL 待測溶液，其余添加溶液不變?？瞻捉M僅添加150 μL 甲醇。以維生素C 作為陽性對照。按照公式計算DPPH 自由基清除率，以清除率為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各對照品的半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

3 結(jié)果與分析

3.1 金銀花提取物的離線二維色譜分析

本課題組在前期研究中建立了RP-HPLC-DAD法分析金銀花活性成分的方法[28]，并且發(fā)現(xiàn)金銀花甲醇水提取物中活性成分較多，種類較為復(fù)雜，含量差異較大，除綠原酸和異綠原酸含量較高外，其他大部分成分含量較低[16]。另外，部分化學(xué)成分極性較高，采用反相色譜柱難以分離。含量和極性的顯著差異對在線篩選的分辨率和靈敏度提出了更高要求。針對以上問題，本研究采用反相半制備液相色譜技術(shù)，根據(jù)色譜圖中各色譜峰的出峰順序和含量特點，對金銀花提取物進(jìn)行初步分離，從而實現(xiàn)低含量成分的富集和不同極性成分的初步分段。進(jìn)一步采用不同類型色譜柱進(jìn)行分析，以提高在線篩選的分辨率和靈敏度。

3.1.1 一維色譜條件優(yōu)化 反相高效液相色譜系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離純化中，具有高效率，高分離度和高回收率的優(yōu)點[29]。本部分利用反相半制備液相色譜技術(shù)將金銀花提取物進(jìn)行分段分析。在本研究中，考慮到金銀花提取物的復(fù)雜性，采用梯度洗脫方法進(jìn)行初步分離。通過半制備液相色譜柱洗脫出的樣品按照極性和含量等綜合評估分別收集A、B、C 3 個流分（制備分離結(jié)果見圖1）。其中，流分A 所含化學(xué)成分極性較強(qiáng)且含量較低，流分C 化學(xué)成分極性稍弱、含量亦較低，需要多次進(jìn)行富集。為從金銀花中發(fā)現(xiàn)更多的低含量抗氧化成分，本研究對流分A 和C 進(jìn)行了多次制備和濃縮，對流分B 進(jìn)行了適當(dāng)制備濃縮。

圖1 金銀花流分富集制備HPLC 圖譜 (280 nm)Fig.1 Preparative chromatogram of Lonicerae Japonicae Flos segmentation (280 nm)

3.1.2 二維色譜分析條件優(yōu)化 流分A在半制備液相上出峰較快。所含化學(xué)成分極性較強(qiáng)，采用普通反相色譜柱難以實現(xiàn)其有效分離，因此選用親水色譜柱進(jìn)行分析?？疾炝薠BridgeTMHILIC column（150 mm×2.1 mm，3.5 μm），SeQuantTMZIC-HILIC column（150 mm×2.1 mm，3.5 μm；）和XBridgeTMAmide column（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）3 根不同的親水色譜柱對該組分的分離效果。結(jié)果表明，利用XBridgeTMAmide column（250 mm×4.6 mm，3.5 μm）進(jìn)行分離時，出峰數(shù)量較多、分離度較好、峰形較尖銳，因此選用該色譜柱對流分A 進(jìn)行色譜分離。流動相是影響色譜分離的又一項重要因素。經(jīng)過考察發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水體系梯度洗脫可以實現(xiàn)流分A 中化學(xué)成分的較好分離。為了改善色譜峰拖尾現(xiàn)象，經(jīng)過優(yōu)化在水相中加入0.8%甲酸、10 mmol/L 甲酸銨可以得到較好的色譜峰型。HILIC 色譜柱分離效果受柱溫影響較大，因此本研究考察了4 個不同柱溫（25、30、35、40 ℃）對色譜分離的影響。結(jié)果表明，柱溫為35 ℃時，峰形尖銳、分離度高、對稱性好。優(yōu)化后的色譜圖見圖2-A。

根據(jù)流分B 在半制備液相色譜上的出峰時間，選擇反相色譜柱進(jìn)行分析。另外，由于流分B 中化學(xué)成分較多，各成分間極性差異性較小，單純采用乙腈-水體系梯度洗脫難以實現(xiàn)其有效分離。進(jìn)一步考察了在乙腈中加入不同比例水（5%、10%、15%）的分離效果，結(jié)果表明，采用乙腈（10%水）-水體系，梯度洗脫，可以實現(xiàn)流分B 的較好分離。同時，考慮到金銀花中所含主要化學(xué)成分為酚酸、黃酮類化合物，易造成C18柱拖尾現(xiàn)象，通過優(yōu)化考察，在水相中添加一定比例的酸（0.6%甲酸）以達(dá)到改善色譜峰形的效果。在優(yōu)化的色譜條件下，流分B的色譜分離圖見圖2-B。

流分C 在半制備色譜柱上出峰時間較晚，說明其極性稍弱，本研究采用反相色譜柱用于其分析研究。采用跟流分B 相同的方法和思路對流分C 色譜 條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，最終選用 0.8%甲酸和10mmol/L甲酸銨作為流動相A，乙腈作為流動相B，柱溫40 ℃作為最優(yōu)色譜條件用于分析，所得色譜圖如圖2-C 所示。

圖2 金銀花不同流分 (A～C) 的HPLC-DPPH 篩選圖譜Fig.2 H PLC-DPPH screening ch romatogram o f honeysuckle fraction A, B and C

3.2 提取物的在線篩選

3.2.1 在線篩選條件優(yōu)化 本研究所用在線篩選條件是在本課題組前期建立的在線抗氧化篩選模型[26]基礎(chǔ)上進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整。重點針對DPPH 溶劑、DPPH 濃度、DPPH 體積流量和反應(yīng)池規(guī)格（內(nèi)徑和長度）等進(jìn)行優(yōu)化考察。

由于流分A、B、C 的色譜分析均采用乙腈-水為流動相，為了保證基線穩(wěn)定，研究選取3 種不同體積分?jǐn)?shù)（50%、80%、100%）的乙腈作為DPPH溶解溶劑進(jìn)行了對比優(yōu)化。結(jié)果表明，針對該實驗體系80%乙腈水為溶劑時基線較為平穩(wěn)。通過對比3 個不同濃度的DPPH 溶液（0.6、6、60 μmol/L）的篩選效果，可以看出在一定范圍中篩選效果隨著濃度的增大而增大，直至平穩(wěn)。但過大的濃度影響基線的穩(wěn)定性。因此，選擇60 μmol/L 作為最適濃度用于篩選。另外，針對不同色譜分離條件需優(yōu)化調(diào)整DPPH 溶液泵入體積流量，本研究結(jié)合各組分色譜條件對0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL/min 5 個DPPH溶液泵入體積流量進(jìn)行分析，結(jié)果表明在合適的范圍內(nèi)隨著泵入體積流量的增大，倒峰峰高不斷增高，漸趨平穩(wěn)。但相應(yīng)可知，過大的體積流量會造成基線的強(qiáng)烈波動影響篩選靈敏度。因此，流分A 篩選體積流量確定為0.8 mL/min，流分B 和C 篩選體積流量確定為0.4 mL/min。

反應(yīng)池規(guī)格會影響反應(yīng)時間的長度，從而影響篩選效果。反應(yīng)池規(guī)格包含反應(yīng)管內(nèi)徑和反應(yīng)管長度兩項。本實驗對2 種內(nèi)徑（0.18、0.25 mm）和3個長度（5、10、15 m）進(jìn)行優(yōu)化分析。研究結(jié)果表明：反應(yīng)管越短，峰寬越窄，負(fù)峰分離度越高；反應(yīng)管越長，峰高越高，負(fù)峰分離度越差。反應(yīng)管內(nèi)徑越小，峰寬越窄，負(fù)峰分離度越高；反應(yīng)管內(nèi)徑越大，峰高較高，分離度越差。綜合考慮以上因素，確定內(nèi)徑為0.25 nm，長度為10 m 的PEEK 管為流分A 最適反應(yīng)池，確定內(nèi)徑為0.25 nm，長度為10 m 的PEEK 管為流分B、C 最適反應(yīng)池。

3.2.2 抗氧化成分的篩選 采用最優(yōu)化的色譜分析條件和在線篩選條件對金銀花提取物的3 個組分進(jìn)行抗氧化成分在線篩選，結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，金銀花提取物A、B、C 3 個流分均實現(xiàn)了較好的色譜分離，色譜峰的數(shù)量較金銀花提取物的色譜圖（圖1）明顯增加，且色譜峰信號強(qiáng)度適中，可以滿足在線篩選的需求。最終，在A 組分中共篩選出7 個具有抗氧化活性的化合物，B 組分中共篩選出12 個具有抗氧化活性的化合物，C 組分中篩選出17 個抗氧化活性成分。綜合上述篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過離線二重分離分析后，在金銀花不同極性組分中共篩選出36 種具有抗氧化活性的化學(xué)成分，研究結(jié)果明顯優(yōu)于文獻(xiàn)報道中金銀花中的抗氧化成分?jǐn)?shù)量[30]。

3.3 抗氧化成分的ESI-Q-TOF/MS 鑒別

按最優(yōu)化的HPLC 條件和ESI-Q-TOF-MS 條件對流分A、B、C 分別進(jìn)行高分辨飛行時間質(zhì)譜分析，根據(jù)各化合物的精確相對分子質(zhì)量、特征吸收波長，并參照文獻(xiàn)報道[31-33]對篩選出的抗氧化活性成分進(jìn)行鑒別，結(jié)果見表1。其中，初步鑒定出12種活性成分。另外，由表1 信息結(jié)合各類化合物的光譜特征可以看出金銀花中篩選出的抗氧化成分以有機(jī)酸類為主，同時含有部分黃酮類成分等，以化合物B4 為例，其m/z609.133 2 為 [M－H]-峰，碎

片離子含有300.028 3 且其在254、327 nm 處有較大吸收，符合黃酮類化合物甲醇溶液在200～400 nm 的區(qū)域內(nèi)存在2 個主要的紫外吸收帶——峰帶I（300～400 nm）和峰帶II（220～280 nm）的特征,因此結(jié)合文獻(xiàn)報道[34]鑒定化合物B4 為黃酮類化合物蘆?。谎芯勘砻鹘疸y花中有機(jī)酸類化合物紫外特征吸收光譜最大值約在280、330 nm[35]，化合物B8m/z515.115 9 為 [M－H]-峰，且含有離子峰 [M＋H]+517.131 9 和 [M＋Na]+539.113 6，因此初步鑒別B8為有機(jī)酸類化合物異綠原酸，結(jié)合出峰順序等因素判定其為異綠原酸A。

表1 金銀花中抗氧化成分ESI-Q-TOF-MS 鑒別Table 1 ESI-Q-TOF-MS identification of antioxidants in Lonicerae Japonicae Flos

3.4 活性驗證

本研究采用化合物體外DPPH 自由基清除試驗來實現(xiàn)單體化合物的活性驗證。測定了其中9個化合物的抗氧化活性及IC50值，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，這9 個化合物均具有一定的抗氧化活性且在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系。其中異綠原酸B 的IC50值最小（19.0 μmol/L），表明其抗氧化活性最好。對比各化合物的IC50值，得出抗氧化活性順序為：異綠原酸B＞異綠原酸A＞1,3-二咖啡?？鼘幩幔井惥G原酸C＞蘆?。倦[綠原酸＞綠原酸＞維生素 C＞新綠原酸＞木犀草苷。其中，有7 種成分的抗氧化活性明顯優(yōu)于陽性對照維生素C。該結(jié)果進(jìn)一步表明金銀花的抗氧化活性是其中所含多種抗氧化成分共同作用的結(jié)果。

表2 金銀花中抗氧化成分活性驗證Table 2 Antioxidant activity verification of components in Lonicerae Japonicae Flos

4 討論

本研究建立了離線二維色譜-DPPH-ESI-Q- TOF/MS 法系統(tǒng)篩選金銀花中抗氧化活性成分的方法。通過該發(fā)法從金銀花提取物中共篩選出36 種具有抗氧化活性的成分，采用高分辨質(zhì)譜鑒別出12種，體外DPPH 自由基清除活性驗證實驗表明，其中7 種成分的抗氧化活性優(yōu)于陽性對照（維生素C）。該方法克服了金銀花化學(xué)成分種類多、含量和極性差異較大而造成的抗氧化成分篩選假陰性問題。為后續(xù)從復(fù)雜體系中較為全面的篩選抗氧化活性成分提供了新的研究思路和方法技術(shù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突