β-地中海貧血修飾基因研究進展

龍嵐 賀靜

人類β-珠蛋白基因簇位于11p15.3，5 個功能基因從5'→3'端依次為ε-Gγ-Aγ-δ-β（圖1），其中，ε-基因在胚胎期表達，Gγ 和Aγ-基因在胎兒期表達，δ 和β-基因在出生后表達［1］。在紅系發育過程中，β-珠蛋白基因的表達經歷2 次轉換，第一次是胚胎期表達的ε-基因被胎兒期的γ-基因取代；第二次是胎兒期的γ-基因被成人期的β-和δ-基因取代［1］。珠蛋白基因表達轉換過程中，都有特異性紅系因子的參與［2］。1975年，Stamatoyannopoulos G報道了同時患有鐮刀型細胞貧血（Sickle cell anae-mia，SCA）和遺傳性胎兒血紅蛋白持續增高癥（Hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH）的黑人患者并沒有表現出貧血的癥狀，這種以前未確定的HPFH 的形式可能解釋了胎兒血紅蛋白（Fetal haemoglobin，Hb F）異常升高的SCA 患者輕度的臨床表現和血紅蛋白表型［3］。這種HPFH 對重型β-地貧患者也有修飾作用［4-5］。β-地中海貧血修飾基因（β-Thalassemia modifier genes）能影響珠蛋白的表達、合成及穩定性，導致具有相同致病基因型患者的臨床表型出現差異［6］。研究發現，中國南方是β-地貧高發區［7-8］。本文將對國內外影響Hb F表達的修飾基因：Xmn1-HBG2基因、HBS1L-MYB基因、反式作用因子、紅系相關轉錄因子和鋅指轉錄因子調控γ-珠蛋白進行總結，并對它們調控γ-珠蛋白表達的機制進行闡述，以期為中國β-地貧患者的γ-基因表達減輕或治愈β-地貧患者癥狀提供參考。

1 Xmn1-HBG2 基因、HBS1L-MYB 基因對γ-珠蛋白基因的調控

1.1 Xmn1-HBG2 基因

Xmn1（C>T）多態性是HBG2基因中對β-地貧起修飾作用的重要數量性狀位點（Quantitative trait loci，QTL），研究發現，HBG2基因-158 位點Xmn1（C>T）的多態性能明顯提高歐洲、美洲、非洲和亞洲等不同人群中β-地貧患者或SCA 患者的Hb F 的表達水平，減輕β-地貧或SCA 的嚴重程度［5，9-12］。研究人員對該位點的不同基因型進行研究，發現相比于“CT”和“CC”等位基因型的人群“TT”等位基因型的人群Hb F 有更高表達水平［13-14］。最近研究表明，Xmn1 多態性的“T”等位基因會導致轉錄抑制子與β-LCR 的結合減弱，引起HBG2基因在成人期持續表達［14］。進一步研究表明，Xmn1 對β-地貧的修飾作用與位于β-珠蛋白基因位點控制區（Locus control region，LCR）超敏位點（DNase I-hypersensitive site，HS）（圖1）處的回文位點有關［15-16］。

圖1 γ-珠蛋白基因調控示意圖［1］Figure 1 γ-globin gene regulation schematic diagram［1］

1.2 HBS1L-MYB 基因

骨髓母細胞瘤基因（Myeloblastosis oncogene，MYB）編碼一個特異性序列的DNA 結合蛋白MYB，MYB 是造血和紅細胞生成的關鍵轉錄因子，它對調節γ-基因表達起重要作用，是β-地貧的關鍵修飾因子［17］。研究表明，MYB 可以通過兩種方式抑制γ-珠蛋白基因表達［1，18］。其一，它能直接激活紅系Kruppel 樣因子（Kruppel-like factor 1，KLF1）的表達，通過KLF1 抑制γ-珠蛋白基因的表達。其二，2014年Stadhouders 等［18］發現該基因間區域存在紅系轉錄因子復合物結合的保守核心調控序列（-87，-84，-71 和-63），它們是紅系轉錄因子復合物（LDB-1/NLI，GATA-1，TAL-1 和ETO-2）的主要結合位點，這些紅系轉錄因子能與遠距離的MYB相互作用并調控MYB表達，通過調控MYB的表達進一步調控紅系分化（圖1）。進一步研究表明，HBS1L-MYB基因間的突變減少了紅系轉錄因子（LDB-1、GATA-1、TAL-1、ETO-2 以及KLF-1）與該基因的結合，影響了紅系轉錄因子與遠距離增強子MYB基因的相互作用和MYB的表達水平，引起Hb F 表達升高［18］。大多數報道的HBS1L-MYB基因區域上引起Hb F 升高的SNP 位點包括rs66650371位點3-bp 缺失，rs9399137，rs4895441 等［19］。

2 反式作用因子對γ-珠蛋白基因的調控

2.1 BCL11A

B-cell lymphoma/leukemia 11A（BCL11A）是γ-基因的抑制子，由位于染色體2p15-16.1 上的BCL11A基因表達，主要存在于腦和造血組織中；BCL11A基因與Hb F 的表達相關，在成人紅系祖細胞中BCL11A基因的高表達引起Hb F 表達水平降低，而BCL11A基因的低表達則會引起Hb F 的表達水平升高［20-21］。全基因組關聯研究表明，BCL11A 與β-珠蛋白基因中富含G 的GGCCGG 序列特異性結合，抑制了γ-基因的表達［21］。這種富含G 的GGCC-GG 序列主要存在于LCR 的HS3、δ-珠蛋白基因上游與Hb F 高表達相關的Corfu 缺失區域以及Aγ-珠蛋白基因的下游區域。BCL11A 可通過招募核小體重塑和去乙酰化酶復合物（The nucleosome remodeling and deacetylase complex，NuRD）與GATA-1 和FOG-1協同作用，導致γ-珠蛋白基因沉默。在成人紅系細胞中，BCL11A基因的突變導致了BCL11A 表達下調可以重新激活γ-基因表達，升高Hb F 水平［21-22］。BCL11A基因間引起Hb F 升高的SNP 位點包括rs766432、rs4671393 和rs11886868 等［23］。

2.2 KLF1

KLF1 是紅系分化過程中重要的調控因子，通過多種機制調控紅系分化。KLF1 是由位于染色體19p13.2 上全長約3kb 的含有三個外顯子的KLF1基因編碼的包含362 個氨基酸的含有鋅指結構的蛋白，其功能結構域有兩個：一個是羧基末端結構域，另一個是富含脯氨酸的氨基末端激活結構域［24］。KLF1 與β-珠蛋白基因啟動子區域的CACCC 盒結合，促進了LCR 區的HS3 位點與β-基因啟動子區域結合，進一步激活β-珠蛋白的表達［25］。KLF1 也能直接調控BCL11A 表達，在人臍帶血來源的紅系祖細胞-2（Human umbilical cord blood derived erythoid progenitor-2，HUDEP-2）中，敲除KLF1基因的增強子HS1 能夠引起KLF1 和BCL11A 的表達同時降低，從而開放γ-基因表達；進一步研究發現BCL11A基因啟動子的-371 位點存在保守的KLF1 的結合位點CACCC 盒，表明KLF1 在體內直接調節BCL11A 的表達［26］。KLF1基因的一些良性突變引起的HPFH 對重型β-地貧患者起到修飾作用，中國人群KLF1基因的c.525_526insCGGCGCC、c.892G>C 和c.1012C>T 突變引起Hb F 水平升高［27］。

2.3 ZBTB7A

Zinc finger and BTB domain containing 7A（ZBTB7A）或 稱The lymphoma/leukemia related factor（LRF）是Gγ-基因的抑制子，是由ZBTB7A基因編碼的Krüppel 家族的鋅指結構域的轉錄因子［28，30］。研究發現，ZBTB7A 和BCL11A 分別結合在Gγ-基因的-200 和-115 位點，抑制Gγ-基因表達；這些結合位點的點突變導致ZBTB7A 和BCL11A 與Gγ-基因-200 和-115 位點的結合減弱，引起Gγ-基因開放表達［28，30］。ZBTB7A基因的啟動子區包含保守的CACCC 盒，在HUDEP-2 中，KLF1 與ZBTB7A的啟動子區CACCC 盒結合直接激活ZBTB7A表達ZBTB7A 蛋白，并通過ZBTB7A 調控紅系分化。ZBTB7A啟動子區KLF1 的結合位點突變會導致KLF1 結合減弱，γ-珠蛋白基因開放表達［29-30］。

3 紅系相關轉錄因子對γ-珠蛋白基因的調控

1988年，Evans 等［31］發現了第一個紅系轉錄因子GATA-1，它通過識別并結合珠蛋白基因簇上的GATA 盒，調控紅系分化。從胚胎發育的第5 天起，在每個階段的紅系細胞中都包含某種活性因子，即紅細胞特異性因子（The erythroid-spe-cific factor，Eryfl），Eryfl 是紅細胞特有的，在其他類型的細胞中，這種Eryfl 不存在或者其活性受到抑制［31］。

3.1 NF-E4

NF-E4 是紅系分化的重要調控因子，對調控β-珠蛋白基因簇上的基因表達起重要作用。1988年，Choi OR 和Engel JD［32］首次提出珠蛋白基因之間競爭單一調控序列（即啟動子競爭），它是一種珠蛋白時序性表達的調控機制，啟動子競爭表明，階段選擇性元件（Stage selector element，SSE）是β-珠蛋白基因簇上的每個獨立的基因優先表達所必須的一個元件。在胎兒紅系細胞中，NF-E4 與CP2 形成階段選擇性蛋白（Stage selector protein，SSP）復合物，然后SSP 結合到γ-基因的SSE 上并形成SSP-SSE 復合物，調控γ-基因表達［33-34］。在成人紅細胞生成過程中，SSP 復合物與β-基因的啟動子中的SSE 結合，使得β-基因與LCR 相互作用引起β-珠蛋白表達［33］。在成人紅細胞中，SSP 復合物結合在γ-基因啟動子-202（C→G）的突變位點上，引起HPFH，對β-地貧患者起修飾作用［35］。研究證明了由NF-E4 組成的SSP 復合物的結合位點是絕對保守的，這些位點包括ε-啟動子、HS2 和HS3 等［33］。

3.2 CTDSPL2

CTD 小磷酸酶樣2 蛋白（CTDSPL2）由RNA聚合酶II C-末端結構域磷酸酶2（RNA polymerase II c-terminal domain small phosphatase like 2，CTD-SPL2）基因表達，它在K562 細胞和臍帶血來源的CD34+細胞中高表達［36］。研究認為，該蛋白一方面可能與一些重要的珠蛋白相關轉錄因子如EKLF，FKLF 和NF-E4 等相互作用而被招募到ε-和γ-珠蛋白基因的轉錄起始復合物中，促進紅系細胞的紅系分化（圖1）［36］；另一方面，CTDSPL2 是一個新出現的磷酸酶家族，它的亞家族包括小CTD 磷酸酶（Small CTD phosphatases，SCPs），CTDSPL2 可能調節珠蛋白基因表達中關鍵因子的磷酸化狀態，促進紅系細胞的紅系分化，這些結論還需進一步深入研究［37］。

3.3 NuRD 復合物

NuRD 是分子量為1MDa 的多亞基蛋白復合物，包括CHD4（Mi2β），MTA1/2/3，p66β（GATAD2b），p66α（GATAD2a），HDAC1/2 和MBD3［21，38］。研究發現，NuRD 在調控γ-珠蛋白表達中扮演重要角色，GATA1-FOG1-Mi2-NuRD 復合物結合在-566 的GATA 位點導致Aγ-基因的沉默；MBD3-NuRD 可以直接和GATA1-FOG1 結合，形成GATAl-FOGl-MBD3-NuRD 復合物并通過GATA1 直接結合在γ-基因啟動子區來抑制γ-基因的表達［39］。MBD2-NuRD 以間接方式使γ-基因啟動子區高度甲基化，抑制γ-基因的表達［40］。CHD4（Mi2β）-NuRD 則直接與KLF-1和BCL11A的啟動子區結合，正向調控這兩個轉錄因子來調控γ-基因表達，而GATAD2A 抑制γ-基因表達的機制主要有兩種：首先它能直接和MYB啟動子區結合來正向調控MYB表達，從而抑制γ-基因表達；其次它與TGATAA 序列結合，直接抑制γ-基因表達［41］。

4 鋅指轉錄因子對γ-珠蛋白基因的調控

4.1 LYAR

Ly-1 antibody reactive clone（LYAR）是具有鋅指結構的DNA 結合轉錄因子，在K562 細胞以及人類紅系祖細胞中，LYAR 與γ-基因5′-非翻譯區（5′-Untranslated region，5′-UTR）的+26 或+32 GGTTAT 序列結合，與組蛋白精氨酸甲基轉移酶PRMT5 相互作用，引起組蛋白H4 精氨酸3 的對稱甲基化（Symmetric methylation of histone H4 Argi-nine 3，H4R3me2s），調控γ-基因的表達（圖1）［22］。研究發現Aγ-基因（HBG1）5′UTR 上+25 處的rs368698783 位點突變率相當高，它處于γ-基因抑制因子LYAR 結合序列GGTTAT 上，并與Gγ-158（XmnI）多態性幾乎完全連鎖，Aγ+25 突變會使LYAR 結合程度減弱，導致在紅系壓力下開放γ-基因表達［42］。

4.2 GATA-1

GATA-1 由位于X 染色體上的GATA基因表達，它通過識別珠蛋白基因簇上的GATA 盒并與其結合，以多種方式調控珠蛋白基因表達［43］。在人成熟紅細胞生成過程中，GATA1、FOG1 和Mi2形成GATA1/FOG1/Mi2 復合物然后結合到γ-基因近端啟動子-566/-567 的GATA 基序位點，部分參與沉默γ-基因（圖1）［44］。在紅系細胞中的β-基因HSSs 位點，尤其是在HS2 核心區域，發現一個復合物E 盒/GATA復合物，由GATA-1/LMO-2/TAL-1/LDB-1 組成，其中LDB-1/NLI 的N-端保守的自交互結構域直接與GATA-1 相互作用，而保守的C-端LIM 結構域和LIM 蛋白（LMO2）相互作用，然后結合SCL 組成新的復合物LDB-1/GATA-1/SCL/LMO2［45］。在GATA1 的作用下，LDB-1/GATA-1/SCL/LMO2 結合到β-基因的HS2 上形成染色質環調控γ-基因沉默，此復合物的高表達對調控紅系分化是必要的［45］。GATA1 還和NF-E2 蛋白協同激活LCRs，LCR 是強大的遠距離增強子，在紅細胞生長發育過程中以適當的方式調控珠蛋白基因簇轉錄［45］。

5 小結與展望

β-地貧修飾基因是目前研究β-地貧基因治療的熱點，它通過調控珠蛋白的表達，影響β-地貧的癥狀。其中最為常見的修飾基因有Xmn1-HBG2基因、HBS1L-MYB基因、反式作用因子、紅系相關轉錄因子和鋅指轉錄因子等，它們都能調控珠蛋白的表達，但是調控方式卻不盡相同，作用機制也尚不完全清楚。是否還有其他的修飾基因通過另外的調控方式和作用機制影響珠蛋白表達水平，這就需要科研人員進一步對β-地貧開展大樣本量的遺傳學分析和機制研究，以期發現新的修飾基因并闡明新的作用機制，并為β-地貧的臨床用藥、基因治療和個體化醫療提供指導。