前列腺癌中CD147、MMP-2 mRNA表達與臨床分期、病理學分級的關系

吳狄 鄧海媚 姚睿智 陳銘

前列腺癌（prostate cancer，PCA）為前列腺泡細胞異常無序生長而產生的惡性腫瘤，其在全世界范圍內發病率位居第二位，死亡率位居第六位［1］。近年來我國前列腺癌發病率呈顯著上升趨勢［2］，如何提高其早期診斷水平是目前研究熱點。腫瘤的發生、生長失控及浸潤和轉移為一個涉及多因素、多步驟的復雜過程，而細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子（extracellular matrix metalloprotein-ase inducer，EMMPRIN）又稱為CD147，作為一種重要的跨膜糖蛋白，CD147 在腫瘤生長、浸潤與轉移等過程中均發揮著重要作用。其在多種腫瘤細胞中均有不同程度表達，可能與其促進腫瘤生長有密切關系，是目前腫瘤研究的新興熱點［3］。基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase，MMP-2）屬于明膠酶，為基質金屬蛋白酶的一種，可特異性破壞基底膜，同腫瘤轉移有密切關系，對判斷疾病病情進展有指導意義［4］。但目前關于CD147、MMP-2 在前列腺癌中的表達現狀研究較少。本文將評估CD147、MMP-2 在前列腺癌中的臨床意義，旨在為臨床準確診斷前列腺癌提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年4月至2018年12月本院收治的前列腺癌患者58 例及同期行手術治療的前列腺增生患者50 例為研究對象。前列腺癌納入標準：①均符合前列腺癌診斷標準［5］，且在術前未接受內分泌治療或放化療；②入院時Gleason 評分在2 分及以上，TNM 分期T1～4 期；③知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標準：①其他類型惡性腫瘤患者；②病歷資料不全；③配合依從性差者。58 例前列腺癌：年齡平均（60.15±6.18）歲；臨床分期：T1～T2 期31例，T3～T4 期27 例；病理學分級2～4 級31 例，≥5 級27 例；淋巴結轉移N0 期30 例，N1 期28 例；遠處轉移M0 期30 例，M1 期28 例。另選擇同期行前列腺摘除術與經尿道前列腺電切術的良性前列腺增生患者50 例，年齡平均（60.11±6.24）歲，均知情同意本研究。本研究獲得院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 標本采集

術中收集前列腺癌患者的病灶組織、癌旁組織及前列腺增生患者的組織標本。將所有前列腺組織以石蠟包埋，每張切片0.5 μm，連續切片5張，壓片烘干后標記上病例編號。

1.2.2 實驗試劑

CD147mRNA 原位雜交試劑盒與地高辛標記的CD147 相關寡核苷酸探針均購自武漢博士德公司；MMP-2mRNA PCR 檢測試劑盒購自日本TaKaRa 公司。

1.2.3 檢測方法

CD147mRNA 以焦炭酸二乙酯（DEPC）清洗原位雜交試驗中的器皿、蒸餾水。陰性對照組中只加雜交液，不加探針。檢測步驟：將石蠟切片進行脫蠟和水化，應用3%H2O2將過氧化物滅活，以蛋白酶K 進行消化處理，暴露mRNA 的核酸片段，以預雜交封閉片段上非特異性雜交點，后進行二次雜交，以地高辛標記的CD147 探針處理。雜交后，去除非堿基配對RNA，以抗體連接，二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，常規采用蘇木精復染，后脫水，透明，封片。MMP-2mRNA：依據試劑盒說明書提取RNA，逆轉錄獲得cDNA，將cDNA 擴增為MMP-2，以β-actin 為內參，PCR 反應條件：95℃30 s，循環42 次；95℃5 s，循環42 次；60℃，45 s，循環42 次。以-2△△CT法計算mRNA 相對表達強度，重復測定3 次后取平均值。

1.2.4 病理結果的判讀

由2 名經驗豐富的病理醫師進行評判，細胞膜與細胞質內出現淡黃色或棕黃色為陽性細胞，以半定量積分法［6］對原位雜交結果進行判斷，其中染色強度為淺黃色記1 分，深黃色記2 分，棕黃色記3分，隨機找到5 個400 倍的視野進行觀察，統計陽性細胞在視野范圍內占比，陽性細胞率<5%記1分，陽性細胞率在5%～25%記2 分，陽性細胞率在26%～50%記3 分，陽性細胞率>50%記4 分。以上述兩部分分值之和作為最終總分，總分1～3 分為陰性（-），4～6 分為陽性（+），7 分為強陽性（++），陽性率=（陽性+強陽性）/總例數×100%。如圖1。

圖1 病理結果判讀（SP，×400）Figure 1 Interpretation of pathological results（SP，×400）

1.2.5 資料搜集

搜集前列腺癌患者的臨床資料，包括年齡、臨床分期、病理學分級、淋巴結轉移、遠處轉移等，分析前列腺癌患者病灶組織中CD147、MMP-2mRNA 表達水平與各參數的關系。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0 軟件處理數據，計數資料以n(%)表示，采用χ2檢驗，計量資料以（）表示，采用配對樣本t檢驗或獨立樣本t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同組織中CD147、MMP-2mRNA表達水平比較

前列腺癌病灶組織中CD147mRNA 陽性率及MMP-2mRNA 表達水平高于前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織（Z值=16.207，t配對=17.771，P<0.05），前列腺癌癌旁組織CD147mRNA 陽性率及MMP-2mRNA 表達水平也高于前列腺增生組織（χ2=4.776，t獨立=23.193，P<0.05）。見表1。

表1 不同組織中CD147、MMP-2 mRNA 表達水平比較［n（%）］Table 1 Comparison of CD147 and MMP-2 expression levels in different tissues［n（%）］

2.2 CD147、MMP-2 mRNA表達水平與各參數的關系

前列腺癌患者臨床分期T3～T4期、病理學分級≥5級、淋巴結轉移N1 期、遠處轉移M1 期者的CD147mRNA 陽性率及MMP-2 表達水平高于臨床分期T1～T2期、病理學分級2～4級、淋巴結轉移N0期、遠處轉移M0期者，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 CD147 mRNA、MMP-2 mRNA 表達水平與各參數的關系［n（%）］Table 2 Relationship between CD147 mRNA，MMP-2 mRNA and various parameters［n（%）］

2.3 電泳結果

電泳結果顯示，前列腺癌病灶組織中CD147mRNA、MMP-2mRNA 表達水平較前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織高。見圖2。

圖2 電泳結果Figure 2 Electrophoresis results

3 討論

腫瘤的發生是多個基因協調作用的結果，其主要含原癌基因的表達上調及抑癌基因的表達下調。研究發現，前列腺癌的發生可能與遺傳、環境、性激素、基因調控異常等有關，其中基因異常在前列腺癌發生發展中扮演重要角色，不僅能促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡，也可促進腫瘤細胞向周圍組織、遠處器官及淋巴結轉移［7］。本研究結果與鄒桂成等［8］的報道結果（前列腺癌癌組織、前列腺癌癌旁組織、前列腺增生組織CD147 mRNA 陽性率分別為95.08%、32.79%、16.32%）一致，表明CD147 在前列腺癌患者病灶組織中呈高表達狀態。正常組織上皮細胞由一層基底膜及軀體其他部位隔離開，正常細胞無法突破這一層基底膜屏障，而腫瘤細胞經刺激基質細胞釋放基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）可破壞基底膜屏障。在前列腺患者中隨病理分級增加，其惡性程度升高，而基底膜缺失也越大，當腫瘤增大到一定程度時，獲得生成血管能力，這為前列腺上皮肉瘤演變為浸潤性腫瘤提供了良好條件。CD147 作為一種細胞外基質類金屬蛋白酶型誘導分子，可刺激前列腺癌患者外周間質細胞，促進其生成MMPs，繼而使前列腺癌病灶組織中MMPs 水平升高，活性增強，有利于降解細胞外部基底膜與間質等成分，促進了前列腺癌的發生發展［9］。Liang 等［10］的研究也發現，CD147 的DNA 啟動子低甲基化可能是與癌癥相關的CD147 過度表達相關調節機制之一，并可能在前列腺癌發生中起到關鍵作用。但本研究前列腺癌病灶組織中CD147 mRNA 陽性率較鄒桂成報道的略低，可能因患者配合度差或所采用的檢測方法靈敏度不一等因素有關，因此原位雜交法檢測CD147 mRNA 的靈敏度仍有待提高。此外本研究結果說明在前列腺癌中MMP-2 表達水平上升，MMP-2 可能在酶解基底膜與細胞間基質成分中起著“鉆頭”作用，因此也與前列腺癌的發生發展密切相關［11］。

本研究也發現，前列腺癌患者中，臨床分期T3～T4 期、病理學分級≥5 級、淋巴結轉移N1 期、遠處轉移M1 期的CD147 mRNA 陽性率及MMP-2 表達水平較臨床分期T1～T2 期、病理學分級2～4 級、淋巴結轉移N0 期、遠處轉移M0 期者高，與既往研究［12-13］一致，說明前列腺癌患者病灶組織中CD147、MMP-2mRNA 的表達水平與臨床分期、病理分級、淋巴結轉移及遠處轉移等關系密切。此外CD147 也能與MMP-2 等形成復合物，而粘附到腫瘤細胞表面，加強對腫瘤細胞外基質與基底膜的降解，增加腫瘤細胞侵襲力，并誘導血管內皮生長因子生成，介導腫瘤轉移等生物學過程［14-15］。

綜上所述，檢測前列腺癌患者病灶組織CD147、MMP-2 mRNA 有助于推斷其臨床分期、病理學分級及淋巴結轉移、遠處轉移等情況，值得在臨床推廣實踐。