NSCLC組織中Ape1/Ref-1及microRNA-21表達與預后關系

張海燕 馮平 張洪艷 楊雅婷 路云濤

肺癌根據病理形態可分為小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）、非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），其中后者占比80%［1］。由于早期癥狀不明顯，多數患者確診時已進展至晚期，預后較差［2］。臨床常用基于鉑類藥物的一線化療方案，有效率僅有40%左右，多數患者無法從中獲益［3］。為了改善患者生存質量，應根據患者對化療的反應修整治療方案，以獲取最佳療效［4］。脫嘌呤脫嘧啶核酸內切酶/氧化還原因子-1（apurinic/apyrimidinicendonuclease/redoxfactor-1，APE/Ref-1）是一種功能性蛋白，通過調控核轉錄因子氧化還原而影響細胞增殖。既往研究顯示，Ape1/Ref-1 在許多惡性腫瘤中高度表達且影響預后，可能與化療耐藥性有關［5］。微小RNA-21（microRNA-21）為非編碼短鏈RNA，研究證實其表達變化在惡性腫瘤的不同發展階段有所差異［6］。目前關于microR-NA-21 與NSCLC 化療患者預后關系的報道較少。本研究旨在探討二者在NSCLC 組織中表達與化療療效及預后的關系，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2015年10月至2017年10月期間本院78例晚期NSCLC 化療患者組織及癌旁組織。納入標準：①符合NSCLC 診斷標準［7］并經及病理組織學確診；②均接受NSCLC 標準一線化療方案；③臨床資料完整。排除標準：①妊娠期、哺乳期女性；②有化療禁忌癥者；③隨訪資料不完整者。其中男46 例，女32 例；年齡，平均（57.62±11.35）歲；鱗癌47 例，腺癌31 例。本研究在醫院倫理委員會批準下開展，患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法

第1～4 d，予以順鉑注射液（江蘇豪森藥業；H20040813）20 mg/m3/d 靜滴，21 d 為一個治療周期，治療兩個周期后評估療效。

1.3 檢測方法

收集患者癌灶組織及其對應距病灶3 cm 的癌旁組織標本，部分標本常規固定并經石蠟包埋切片，用于免疫組織化學分析，其他標本迅速保存于液氮中，用于RNA 提取。

1.3.1 Ape1/Ref-1 表達檢測

鼠抗人Ape1 單克隆抗體購自美國Novus Bio-logicals，免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。400 倍鏡下，避開壞死區，取10 個視野。染色強度：淡黃色計1 分，黃色計2 分，棕黃色計3 分。陽性細胞數［8］：0 分，1 分，2 分，3 分，4分。染色強度與陽性細胞數計相加，1 分為-，2～3分為+，4～5 分為++，6～7 分為+++，記-、+為低表達，++、+++為高表達。

1.3.2 microRNA-21 表達檢測

制備組織勻漿，加入TRIZOL 試劑（美國Sig-ma-Aldrich），Taqman microRNA 逆轉錄試劑盒（美國ABI）進行逆轉錄，得到的cDNA 樣本采用Taq-man Universal PCR master Mix 試劑盒（美國ABI）擴增。microRNA-21 表達量采用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmicroRNA-21-Ct內參。以癌灶組織microRNA-21表達量/癌旁組織microRNA-21 表達量<2 為mi-croRNA-21 低表達，癌灶組織microRNA-21 表達量/癌旁組織microRNA-21 表達量≥2 為microR-NA-21 高表達［9］。

1.4 療效評估［10］

完全緩解（complete response，CR）；部分緩解（partial response，PR）；疾病穩定（stable disease，SD）；疾病進展（progressive disease，PD）。以（CR+PR）為有效，根據治療效果將患者分為有效組、無效組。

1.5 觀察指標

比較各組Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達水平，采用Spearman 相關性分析化療療效與癌灶組織Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達水平的相關性，采用生存曲線分析總生存期（overall survival，OS）與癌灶組織Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達的相關性。

1.6 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，計量資料采用（）表示，采用獨立t檢驗；計數資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗；采用spearman 秩相關系數進行相關性分析，Kaplan-Meier 法進行單因素生存分析，COX 回歸模型進行多因素生存分析。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 癌灶組織與癌旁組織Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達比較

癌灶組織Ape1/Ref-1 高表達率及microRNA-21 相對表達量均高于癌旁組織，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 癌灶組織與癌旁組織Ape1/Ref-1，microRNA-21 表達比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of Ape1/Ref-1、microRNA-21 between cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

表1 癌灶組織與癌旁組織Ape1/Ref-1，microRNA-21 表達比較［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of expression of Ape1/Ref-1、microRNA-21 between cancer tissues and adjacent tissues［n（%），（±s）］

組別癌灶組織癌旁組織χ2值P 值-+2（2.56）13（16.67）4（5.13）22（28.21）++52（66.67）39（50.00）+++20（25.64）4（5.13）5.656<0.001高表達72（92.31）43（55.13）27.825<0.001 microRNA-21 相對表達量4.65±1.27 2.49±1.62 9.267<0.001

2.2 有效組、無效組癌灶組織Ape1/Ref-1、mi-croRNA-21 表達比較

有效組癌灶組織Ape1/Ref-1、microRNA-21 高表達率均低于無效組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2、圖1。

表2 有效組、無效組癌灶組織Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達比較［n（%）］Table 2 Comparison of Ape1/Ref-1、microRNA-21 expression in cancer tissues between effective group and ineffective group［n（%）］

圖1 癌灶組織免疫組化染色結果示意圖（SP，×400）Figure 1 Schematic diagrams in cancer tissues by immunohistochemical staining（SP，×400）

2.3 化療療效與Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達相關性分析

Spearman 相關性分析顯示，化療療效與癌灶組織Ape1/Ref-1（r=-0.615）、microRNA-21（r=-0.492）表達均呈負相關性（P<0.05）。

2.4 化預后與Ape1/Ref-1、microRNA-21 表達相關性分析

COX多因素分析顯示，癌灶組織Ape1/Ref-1、mi-croRNA-21 表達是影響NSCLC 患者生存率的獨立相關因素（P<0.05）。Ape1/Ref-1 低表達者3年生存率（50.00%）高于高表達者（19.44%），microR-NA-21 低表達者3年生存率（32.61%）高于高表達者（9.38%），差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3、圖2。

表3 NSCLC 預后的COX 多因素回歸分析Table 3 Cox multivariate regression analysis of prognosis of NSCLC

圖2 Ape1/Ref-1、microRNA-21 不同表達患者生存曲線Figure 2 survival curves of patients with different expression of Ape1/Ref-1 and microRNA-21

3 討論

盡管近年來肺癌的早期診斷和治療取得了明顯進展，但仍有多數患者確診時已進展至晚期。早期腫瘤雖可行手術完全切除，但仍有約半數術后出現復發或轉移，預后較差［11］。

NSCLC 的治療中，化療起著重要作用，對于失去手術切除機會的晚期NSCLC 患者，以鉑類為基礎的化療仍是一線治療方案。研究證實，化療可延長NSCLC 患者生存期，但化療耐藥也是造成病情進展的重要因素［12］。近年來針對腫瘤細胞耐藥性機制的研究很多，但仍缺乏可預測、評估NSCLC 化療療效的有效且簡便的生物學指標［13］。Ape1/Ref-1是具有多重功能的DNA 堿基切除修復限速酶，在細胞損傷修復中發揮重要作用，同時也是氧化還原因子，具有調節細胞內核轉錄因子表達的作用。根據既往研究，Ape1/Ref-1 的過表達可增強生殖細胞瘤、腦膠質瘤對放療的抗性［14］。Spearman 相關性分析顯示，化療療效與癌灶組織Ape1/Ref-1 表達呈負相關。分析其可能機制，目前認為主要是由于Ape1/Ref-1 的過表達伴隨DNA 內切酶活性增強，進而導致化療耐藥；同時，Ape1/Ref-1 的結構決定其可調控多種核轉錄因子的表達，這在化療耐藥中發揮更大作用［15］。癌灶組織Ape1/Ref-1 的表達與NSCLC 化療患者預后生存期密切相關，表明Ape1/Ref-1 可作為評估預后的重要參考指標。

microRNA 是一種單鏈非編碼RNA，可調控轉錄后水平基因表達，其中microRNA-21 是目前研究最為廣泛的一種［16］。在既往研究中可見相似結論［17］，提示NSCLC 的發生伴隨microRNA-21 的上調，且microRNA-21 的表達與化療療效密切相關。一方面，microRNA-21 對抑癌基因的表達具有抑制作用；另一方面，microRNA-21 通過調控蛋白酪氨酸磷酸酶基因（protein tyrosine phosphatase gene，PTEN）導致的化療耐藥，使腫瘤細胞順鉑類藥物耐藥性顯著增強，進而影響化療療效。進一步的COX 多因素分析表明，NSCLC 的預后與microRNA-21 表達密切相關，表明NSCLC 組織中microRNA-21 表達可作為預后生存的預測指標。

綜上所述，NSCLC患者癌灶組織中Ape1/Ref-1、microRNA-21 的表達與化療療效及預后密切相關，可為NSCLC 患者預后預測提供參考，其介導化療耐藥的更多機制，尚需進一步研究探討。