MGMT、h MLH1基因在人腦膠質瘤中的表達及對常見藥物化療敏感性的影響研究

王傳璽 梅潔 閆兆月 張鳳平 段冉 丁艮曉

人腦膠質細胞瘤［又簡稱“腦膠質瘤”（glio-ma），后文均用簡稱］在所有顱內病變、顱內惡性腫瘤中占比約為45%、80%［1］。洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺等一線化療藥物在臨床腦膠質瘤治療中幾乎必不可少，具有生物利用度較高、易透過血腦屏障、毒副反應風險低等優勢。然而實際臨床中部分患者化療療效難以盡如人意，孫琳［2］等研究顯示腦膠質瘤患者經替莫唑胺化療藥物獲得有效率僅為34%，重要影響因素即化療藥物耐藥。腦膠質瘤耐藥機制復雜，當前認為可能與多種基因有關，進一步探索腫瘤組織中相關耐藥基因表達水平對腫瘤惡性程度判斷、化療敏感性評價及指導針對性治療有一定現實意義。O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O6-methyl-guanine-DNA methyltransferase，MGMT）、錯配修復基因（Human mutl homolog 1，h MLH1）近年來因已被證實與胃腸道腫瘤、肺癌、乳腺癌等化療耐藥有關而引起了臨床學者廣泛重視［3-5］。本研究旨在分析這兩者基因在人腦膠質瘤中的表達及對常見藥物化療敏感性的影響。

1 標本與方法

1.1 標本來源

于2017年6月至2020年10月，收集本院行開顱手術切除的80 例膠質瘤石蠟切片標本，對應患者術后經細胞學或組織病理學獲得膠質瘤明確診斷［6］；≥18 歲；術前未接受化療等其他相關治療；標本對應病例資料信息完善。男女比例為3∶2；平均年齡（47.55±10.71）歲；病理類型含有39 例（48.75%）星形細胞瘤、19 例（23.75%）室管膜瘤、15例（18.75%）少突膠質細胞瘤與7 例（8.75%）膠質母細胞瘤；世界衛生組織膠質瘤病理分級［7］含有25 例（31.25%）為Ⅱ級、35 例（43.75%）為Ⅲ級、20例（25.00%）為Ⅳ級。同一時期抽取40 例患者經腦外傷減壓切除的腦組織切片標本，明確為正常腦組織，男女比例為3∶2；平均年齡（49.07±11.60）歲，與腦膠質瘤標本對應患者的性別比例、年齡相比差異無統計學意義（P>0.05）。所有患者及家屬均知情同意。本實驗經醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 MGMT 與h MLH1 蛋白免疫組化檢測

腦膠質瘤、正常腦組織標本蠟塊進行修整后，調整位置連續切割3～4 μm 切片，放載玻片烘烤、100%乙醇中脫水后梯度水化，沖洗后放于含抗原修復液的高壓鍋中持續加熱，之后于室溫冷卻完成抗原修復。隨后室溫下封閉孵育，PBS 反復洗滌后即可加入對應抗體（一抗，其中鼠抗人MGMT抗體、兔抗人h MLH1 抗體均購買于美國Abcam公司），4℃冰箱過夜孵育后予以PBS 液再次反復沖洗后即可給予二抗，之后室溫繼續孵育，PBS 液反復沖洗后依次完成DAB 與H2O2顯色液配制、復染、二甲苯浸泡透明、中性樹脂封片、光學顯微鏡下閱片等操作。

1.2.2 結果判讀［8］

隨機擇取5 個高倍顯微鏡（400×）視野，觀察陽性細胞對應染色強度及所占百分比，基于二者的乘積完成最終評分；陽性細胞無著色、著淺黃色、著棕黃色、著棕褐色依次記為0 分、1 分、2 分、3 分，陽性細胞所占百分比<5%、≥5%且<25%、≥25%且<50%、≥50%且<75%及≥75%依次記為0分、1 分、2 分、3 分、4 分；最終評分0 分為陰性（-），1～4、5～8、9～12 分均視為為陽性，分別為（+）、（++）及（+++）。

1.2.3 敏感性試驗

標本除菌洗滌液：含雙抗的無血清RPMI-1640培養液，青霉素與鏈霉索濃度為100 μ/mL；組織培養液：含10%小牛血清的RPMI-1640 培養液，噻唑藍溶液濃度為10 mg/mL，通過生理鹽水配制及除菌處理后備用，4 攝氏度環境避光保存。化療藥物及其對應濃度：洛莫司汀、福莫司汀均為10 μg/mL，替尼泊苷20 pμg/mL，尼莫司汀6.5 pug/mL 及替莫唑胺7 μg/mL。所用藥物濃度均參考說明書所給血漿峰濃度，選用滅菌注射用水作為配藥溶劑。組織培養藥敏采用組織塊培養-終點染色-計算機分析法（tissue culture-end point staining com-puter image analysis，TECIA），組織培養為四孔同步法，可保證組織塊存活及培養成功，即四孔培養基中平均有3 孔以上存活。參照文獻［9］方法計算化療藥物抑制率（IR），藥物敏感性以IR 作為評價標準，IR>50%為敏感，30%～50%為中度敏感，<30%為耐藥。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數據處理，計數資料用n（%）描述，行χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同腦組織MGMT 與h MLH1 基因表達情況

腦膠質瘤、正常腦組織中MGMT 與h MLH1基因表達程度差異比較均有統計學意義（P<0.05）。見表1。MGMT 與h MLH1 均在細胞核呈現棕黃色顆粒或陽性顯色彌散分布。見圖1。

表1 MGMT、h MLH1 表達比較［n（%）］Table 1 expression comparison of MGMT and h-mlh1［n（%）］

圖1 MGMT、h MLH1 基因在腦膠質瘤、正常腦組織中表達（SP，×400）Figure 1 expression of MGMT and H MLH1 genes in glioma and normal brain tissues（SP，×400）

2.2 不同病理類型、分級腦膠質瘤組織MGMT 與h MLH1 基因表達情況

不同病理類型腦膠質瘤組織腦膠質瘤組織中MGMT 與h MLH1 基因陽性表達率均無統計學意義（P>0.05），而病理分級Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級腦膠質瘤組織中MGMT 與h MLH1 基因陽性表達率依次升高，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 不同病理、分級類型腦膠質瘤組織MGMT 與h MLH1 基因表達比較［n（%）］Table 2 Comparison of MGMT and hMLH1 gene expression in different pathological and grading types of gliomas［n（%）］

2.3 化療敏感性與病理特征及MGMT、h MLH1基因免疫組化因子表達強度的關系

莫司汀、替尼泊苷、替莫唑胺敏感率與病理分級有關（P<0.05），MGMT、h MLH1 陽性表達洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺敏感率均明顯低于陰性表達，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 化療敏感性與病理特征及MGMT、h MLH1 基因表達強度的關系［n（%）］Table 3 The relationship between chemosensitivity and pathological features and the expression of MGMT and hMLH1 genes［n（%）］

3 討論

本研究發現MGMT、h MLH1 兩種基因在對應腦組織標本中均在細胞核呈現棕黃色顆粒或陽性顯色彌散分布，而且MGMT 和h MLH1 基因在人腦膠質瘤標本中陽性表達率高，與Deimling［9］等及李孟凱［10］等早期報道結果一致；同時，MGMT 和h MLH1 基因表達與腦膠質瘤病理類型無關，與疾病進展有一定關聯。其中MGMT 作為一種DNA修復酶，具有修復經亞硝脲類化療藥物引起的DNA 烷基化損害作用，可直接影響腦膠質瘤化療效果甚至促使化療失敗，最終導致腫瘤進展。Wen［11］等報道證實腦膠質瘤組織MGMT 基因表達異常升高，且與病理分級及預后密切相關。事實上，h MLH1 基因為h MLH 中重要的一員，在DNA錯配修復功能缺陷中扮演了舉足輕重的角色，被視為包括腦膠質瘤在內的多種腫瘤的診斷特異性指標，王磊［12］等報道即曾證實h MLH1 基因表達與結腸癌發生及進展有關。

本研究中除了病理分級可影響人腦膠質瘤部分藥物化療敏感性以外，MGMT 和h MLH1 基因可影響多種藥物化療敏感性，包括洛莫司汀、福莫司汀、替尼泊苷、尼莫司汀、替莫唑胺，即MGMT、h MLH1 表達程度與化療敏性密切相關。由于MGMT 能夠修復以烷化劑為代表的抗腫瘤藥物引起的細胞損傷，因此可通過腫瘤組織中表達水平反映對烷化劑如洛莫司汀、替莫唑胺等的敏感性［13］。Holmes［14］等學者發現，MGMT 高表達的腫瘤細胞對烷化劑抗癌藥耐藥性比低表達更顯著，認為下調表達陽性或高表達膠質瘤中MGMT 表達對于提高替莫唑胺等一線藥物化療效果有助益。需指出的是，堿基錯配修復系統與MCMT 被視為腦膠質瘤一線藥物產生耐藥的最重要的兩個因素，其中前者作為修復DNA 堿基錯配的安全保障體系，包括多個hMLH 基因，均能夠識別并清楚錯誤或異常配對的胸腺嘧啶，倘若該體系甲基化或突變，極易導致DNA 錯配修復功能缺陷，繼而影響藥物敏感性，而h MLH1 正是錯配修復基因最重要成員之一，極易發生甲基化，并引發錯配修復系統失活［15］。劉容容［16］等證實了h MLH1 基因陽性表達可影響替莫唑胺化療敏感性，也認為可能機制為h MLH1 基因啟動子甲基化增強。上述均說明MGMT、h MLH1 基因與腦膠質瘤治療過程藥物敏感性有關，支持了本研究結論，故推測以上兩個基因對改善腦膠質瘤化療耐藥性有一定指導作用，即通過降低MGMT、hMLH 表達可能能夠降低惡性腦膠質瘤對相關藥物的耐藥性，增強化療敏感性，但其具體實踐效果有待研究證實。此外，MGMT 和h MLH1 基因影響多種化療藥物敏感性的原因還可能為二者均參與促進腦膠質瘤細胞侵襲，但其具體機制有待后續研究論證。