SPAG9 mRNA、Livin mRNA、Caspase-9 mRNA在曼月樂環療程中動態變化及意義

王學博 李松 任紅娟 楊然 孫麗 薛國勇 瞿小玲

近年來曼月樂環成為子宮內膜非典型增生（endometrial atypical hyperplasia，EAH）及早期子宮內膜癌（early endometriod adenoncarcinoma，EEC）的重要保守治療方法，可保留患者生育功能，但不同個體治療反應性差異較大，早期預測曼月樂環的療效，對指導臨床選取合適療法意義重大［1］。精子相關抗原9（Sperm associated antigen 9，SPAG9）是c-Jun 氨基末端激酶相互作用家族的一個新成員，靶向SPAG9，抑制SPAG9 信號通路，可阻斷子宮內膜腺癌細胞中17β 雌二醇誘導的細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化，抑制子宮內膜癌細胞的惡性行為［2-3］。凋亡蛋白抑制因子（Livin）在子宮內膜癌組織中表達顯著升高，并與肌層浸潤深度有關［4］。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）是執行細胞凋亡的主要酶類，可促進癌細胞的凋亡［5-6］。本研究探討SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA在曼月樂環療程中動態變化及意義，旨在為臨床決策提供參考，報告如下。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選取2017年6月至2020年5月本院收治的126 例子宮內膜增生類病變患者患者，其中EAH 13例，EEC 113 例。根據治療后6 個月病理結果分為緩解組（n=101）、非緩解組（n=25）。①納入標準：符合EAH、EEC 診斷標準［7］；均有保留生育功能訴求或拒絕手術要求先保守治療者；入組前未接受過相關治療。②排除標準：已知或懷疑妊娠，未確診的陰道出血；子宮肌瘤者；子宮息肉者；血液系統疾病者；急性感染類疾病者；有節育環過敏史者；宮腔深度>10 cm 者。本研究獲醫院倫理委員會審核通過，患者及家屬充分知情，自愿簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法與療效評定

患者均在宮內放置左炔諾孕酮宮內節育系統（含左炔諾孕酮52 mg/個（20 微克/24 小時），Bayer Yakuhin，Ltd，批準文號H20140237），于治療前、治療后3、6 個月行婦科超聲檢查測量子宮內膜厚度，并按照月經失血圖（Pictorial Blood Loss Assess-ment Chart，PBAC）評分評估患者月經量，PBAC>100 分為月經過多，分值越高，月經量越多［8］。同時于治療后6 個月行子宮內膜組織活檢，緩解：病變完全消失，無EAH、EEC 的組織病理學證據；非緩解：與緩解標準不相符者［9］。

1.2.2SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 檢測

治療前、治療后3、6 個月，采用實時熒光定量PCR 法檢測子宮內膜組織SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 表達，檢測基因相對表達量=2-△△Ct。

1.3 觀察指標

①比較兩組基線資料。②比較兩組治療前、治療后3 個月、治療后6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 動態變化。③比較兩組治療前、治療后3 個月、治療后6 個月PBAC 評分、子宮內膜厚度。④分析SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 與PBAC 評分、子宮內膜厚度相關性。⑤分析曼月樂環療效的相關影響因素。⑥分析治療后3 個月、治療后6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA預測緩解的價值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行處理數據，計量資料以（）表示，兩組間比較行獨立樣本t檢驗，組內比較行配對t檢驗，計數資料用n（%）表示，用χ2檢驗，采用Pearson 進行相關性分析，Logistic 回歸方程行多因素分析，采用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic，ROC）及ROC 下面積（Area under the curve，AUC）分析各指標預測緩解的價值。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基線資料

兩組年齡、疾病類型、體質量指數、疾病類型、婚姻狀態、生育史、既往史比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組基線資料對比［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［n（%），（±s）］

表1 兩組基線資料對比［n（%），（±s）］Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups［n（%），（±s）］

資料年齡（歲）疾病類型EAH EEC體質量指數（kg/m2）偏瘦正常超重肥胖疾病類型EAH EEC婚姻狀態已婚未婚生育史緩解組（n=101）31.97±6.85非緩解組（n=25）33.58±8.02 t/χ2值1.016 P 值0.312 12（11.88）89（88.12）1（4.00）24（96.00）0.628 0.428 20（19.80）42（41.58）25（24.75）14（13.86）2（8.00）14（56.00）4（16.00）5（20.00）3.703 0.295 62（61.39）39（38.61）10（40.00）15（60.00）3.743 0.053 47（46.53）54（53.47）8（32.00）17（68.00）1.721 0.190無有69（68.32）32（31.68）20（80.00）5（20.00）1.319 0.251既往史總膽固醇異常低密度脂蛋白異常高密度脂蛋白異常三酰甘油異常糖尿病冠心病高血壓18（17.82）13（12.87）9（8.91）14（13.86）8（7.92）2（1.98）1（0.99）7（28.00）1（4.00）5（20.00）6（24.00）4（16.00）0（0）2（8.00）0.744 0.825 1.499 0.877 0.725 0.034 1.758 0.388 0.364 0.221 0.349 0.394 0.854 0.185

2.2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA動態變化

緩解組治療后3、6 個月SPAG9、LivinmRNA低于非緩解組，Caspase-9mRNA 高于非緩解組，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 動態變化（±s）Table 2 The dynamic changes of SPAG9，Livin and Caspase-9 mRNA between 2 groups（±s）

表2 兩組SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 動態變化（±s）Table 2 The dynamic changes of SPAG9，Livin and Caspase-9 mRNA between 2 groups（±s）

注：與本組治療前比較，aP<0.05。

組別緩解組非緩解組t 值P 值例數101 25 SPAG9 mRNA Livin mRNA Caspase-9 mRNA治療前0.39±0.16 0.42±0.18 0.819 0.415治療后3 個月0.21±0.10a 0.40±0.14 7.811<0.001治療后6 個月0.15±0.05a 0.43±0.13 17.238<0.001治療前8.15±2.65 7.96±2.31 0.357 0.722治療后3 個月6.04±1.97a 8.11±2.59 4.404<0.001治療后6 個月5.14±1.69a 8.20±2.67 7.138<0.001治療前0.38±0.13 0.41±0.15 1.001 0.319治療后3 個月0.56±0.15a 0.42±0.14 4.231<0.001治療后6 個月0.69±0.21a 0.40±0.13 6.588<0.001

2.3 兩組PBAC 評分、子宮內膜厚度比較

緩解組治療后3、6 個月PBAC 評分、子宮內膜厚度較非緩解組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 兩組PBAC 評分、子宮內膜厚度比較（±s）Table 3 Comparison of PBAC score and endometrial thickness between 2 groups（±s）

表3 兩組PBAC 評分、子宮內膜厚度比較（±s）Table 3 Comparison of PBAC score and endometrial thickness between 2 groups（±s）

組別緩解組非緩解組t 值P 值例數101 25 PBAC 評分（分）子宮內膜厚度（mm）治療前192.56±30.14 189.67±34.28 0.418 0.677治療后3 個月81.66±15.08 105.45±20.63 6.533<0.001治療后6 個月34.48±7.29 91.59±30.05 17.330<0.001治療前12.51±2.09 11.87±2.25 1.350 0.179治療后3 個月5.59±0.92 8.26±2.34 9.055<0.001治療后6 個月4.08±0.74 7.55±2.18 13.313<0.001

2.4 SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 與PBAC 評分、子宮內膜厚度關系

治療后3、6 個月SPAG9mRNA（r=0.369、0.385，P均<0.001）、LivinmRNA（r=0.497、0.566，P均<0.001）與PBAC 評分呈正相關，治療后3、6 個月SPAG9mRNA（r=0.401、0.427，P均<0.001）、Liv-inmRNA（r=0.428、0.519，P均<0.001）與子宮內膜厚度呈正相關；治療后3、6 個月Caspase-9mRNA與PBAC 評分呈負相關（r=-0.514、-0.633，P均<0.001）；治療后3、6 個月Caspase-9mRNA 與子宮內膜厚度呈負相關（r=-0.486、-0.597，P均<0.001）。

2.5 SPAG9、Livin、Caspase-9 mRNA 預測緩解的效能

治療后3、6 個月SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 均是療效的相關影響因素（P<0.05）。見表4。

表4 Logistic 回歸方程分析Table 5 Logistic regression equation analysis

治療后6 個月對療效影響的OR 值大于治療后3 個月，故以治療后6 個月個指標作為源數據進行ROC 曲線分析，結果顯示，治療后6 個月SPAG9mRNA 預測的AUC 為0.843（95%CI：0.768～0.902），截斷值≤0.24，敏感度為74.26%，特異度為88.00%，LivinmRNA 預測的AUC 為0.831（95%CI：0.754～0.892），截斷值≤7.1，敏感度為75.25%，特異度為84.00%，Caspase-9mRNA 預測的AUC 為0.772（95%CI：0.688～0.842），截斷值＞0.62，敏感度為51.49%，特異度為92.00%；各指標聯合預測緩解的AUC 為0.902（95%CI：0.836～0.947），敏感度為73.27%，特異度為96.00%（P<0.05），見圖1。

圖1 預測ROCFigure 1 ROC for prediction

3 討論

SPAG9mRNA 定位于人類染色體17q21，是c-Jun 氨基末端激酶信號通路上的支架蛋白，在調控細胞增殖、凋亡中發揮重要作用。本研究顯示，SPAG9mRNA 在曼月樂環治療后獲得病理緩解患者中呈降低趨勢，非緩解患者SPAG9mRNA 在療程中無明顯變化，可評估患者病情程度。Trava-glino A 等［10］報道納入了27 項針對1 360 名女性的研究，采用免疫組化檢測SPAG9 蛋白在治療前及隨訪期間的變化，發現SPAG9 蛋白降低可預示保守治療的有效性，本研究觀點與之相似。曼月樂環在宮內可緩慢釋放孕酮，引起子宮內膜暫時性萎縮和間質脫膜化，降低黏膜上皮層活性，并控制月經出血量，逆轉子宮內膜增生，抑制具有促進細胞生長、增殖作用SPAG9mRNA 的表達。可見當SPAG9mRNA 在療程中呈降低趨勢時，表明曼月樂環治療具有可行性，否則可能意味著需終止保守治療，以防止病變的進一步進展，從而指導臨床選取合適的治療方式。

凋亡蛋白抑制因子是一類具有抗細胞凋亡的因子，在調節細胞周期和凋亡蛋白酶活性中起到重要作用。Livin 是目前發現的凋亡蛋白抑制因子家族中活性最強的抗凋亡因子，在多種惡性腫瘤中表達顯著升高［11］。細胞培養實驗表明，采用脂質體法瞬時轉染Livin-siRNA 干擾序列，可沉默LivinmRNA 表達，抑制子宮內膜癌細胞的增殖，減弱細胞的侵襲及遷移能力，提示LivinmRNA 與惡性生物學行為有關［12］。但關于LivinmRNA 在EAH 和EEC 曼月樂環療程中變化的報道鮮見。本研究創新性探討發現，曼月樂環治療后獲病理緩解患者LivinmRNA 呈降低趨勢，并低于非緩解患者，而非緩解患者隨著療程推進，LivinmRNA 水平相似，提示LivinmRNA 可作為預測曼月樂環保守治療反應性的分子標志物。遺憾的是，由于本研究觀點的新穎性，缺乏更多報道的進一步論證，尚不明確曼月樂環降低LivinmRNA 表達的詳細機制，有待后續的深入研究。

細胞正常凋亡途徑受阻是異常增殖細胞生存期延長、發生惡性增殖的必經環節。含半胱氨酸的天冬氨酸特異性蛋白酶是細胞凋亡的主要執行者，其中Caspase-9 作為線粒體介導通路的始動因子，可觸發凋亡級聯反應，誘導細胞的凋亡［13-14］。本研究發現，獲病理緩解的EAH 和EEC 患者，在曼月樂環療程中，Caspase-9mRNA 呈上升趨勢，非緩解患者Caspase-9mRNA 無明顯變化，呈現出療效預測的潛質。治療后Caspase-9mRNA 水平升高，可介導EAH 異常增生細胞及EEC 癌細胞的凋亡，抑制細胞異常增殖行為，從而促進病情緩解。若療程中Caspase-9mRNA 降低或處于穩定狀態，則預示療效不佳，應調整治療手段，從而預防病情進一步演變，改善患者預后。另SPAG9、Livin、Caspase-9mRNA 聯合預測緩解的AUC 最大，提示聯合檢測三者能進一步提高預測價值。本研究不足之處在于，因EAH 病例數較少，故將EAH 和EEC 放在一起進行數據的統計分析，而EEC 患者數量較多，可能造成數據的偏倚，有待后續的進一步探討。