老年非小細胞肺癌患者放療前后Treg及Foxp3 mRNA的變化

侯盼飛 祝麗晶 濮娟 潘艷★

肺癌發(fā)病率居惡性腫瘤第1 位，70%以上患者確診時已是中晚期，放療在肺癌的治療中占有非常重要的地位［1］。但是放療在激活機體抗腫瘤免疫的同時，也能引起機體的免疫抑制，出現(xiàn)腫瘤對射線的抵抗［2］。因此，如果放療過程中能夠解除機體的免疫抑制，即放療聯(lián)合免疫治療，可以更有效地增強機體的抗腫瘤效應(yīng)，改善患者的預(yù)后。調(diào)節(jié)性T 細胞（regulatory T cells，Treg）在機體內(nèi)發(fā)揮重要的免疫抑制作用，且與放療密切相關(guān)［3］。本研究通過流式細胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）及實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（reverse-transcription PCR，RT-PCR）測定非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）放療過程中Treg 以及其叉頭狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3（Forkhead helix family transcription factor 3，F(xiàn)oxp3）mRNA 在放療過程中的變化，試圖為患者放療聯(lián)合免疫治療提供干預(yù)的靶點以提高放療療效。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2019年1月-2019年12月收治的40例NSCLC 作為肺癌組，其中男23 例，女17 例；年齡平均（68.55±7.82）歲。納入標準：①年齡≥60 歲；②病理確診為NSCLC［4］；③患者未接受其他治療，且開始采集標本后1月內(nèi)不行手術(shù)及化療，只接受單純放療的患者。排除標準：①慢性阻塞性肺疾病、哮喘急性發(fā)作期；②合并自身免疫系統(tǒng)疾病；③合并感染；④近一月使用過糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑。選取同期在本院查體的50 例健康體檢者作為對照組，其中男27 例，女23 例；年齡平均（67.38±7.99）歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。該項目經(jīng)本院倫理委員會批準且所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑

Varian 23-Ex 直線加速器購自美國Varian 公司，Navios 流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，ABI7500PCR 擴增儀購自美國ABI 公司，人Treg 檢測試劑盒購自美國BD 公司，RT-PCR 試劑盒、RNA 提取試劑及各種生化試劑購自上海生工生物工程股份有限公司。Foxp3基因引物P1：5′-CTGGGCTCCTCGCCTGAC-3′，P2：5′-CTCTCT-GCCCTCAGCCTTGC-3′，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 放療方法

采用Varian 23-Ex 直線加速器，肺癌組患者均采用6 MV X 線IMRT 外照射，常規(guī)分割2.0 Gy/f，總劑量DT 60 Gy/30f。

1.4 血樣采集

對照組清晨空腹采集靜脈血5 mL，采用肝素抗凝。肺癌組分別于放療前、放療期間（每隔6 次放療）采集標本，方法同對照組。

1.5 Treg 檢測

取靜脈血100 μL 加入已標記好的流式管，分別加入FITC Mouse Anti-Human CD4、PE Mouse Anti-Human CD25、Alexa FluorR647 Mouse anti-Hu-man CD127 各20 μL，室溫避光孵育15 min；加入裂解液，震蕩混勻室溫避光15 min，1 200 r/min 離心5 min，棄上清后加入2 mL PBS，1 200 r/min 離心5 min；棄上清后加入500 μL PBS 震蕩后，流式細胞儀檢測Treg 占CD4+T 淋巴細胞百分比。

1.6 Foxp3 mRNA 檢測

Trizol 法提取血漿總RNA，用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 作為模板，按照試劑說明書配制反應(yīng)體系，采用ABI7500 PCR 儀檢測Foxp3mRNA 的相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與肺癌組放療前外周血檢測指標的比較

肺癌組放療前外周血Treg 占CD4+T 淋巴細胞百分比以及Foxp3mRNA 相對表達量均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1、圖1。

表1 兩組外周血Treg 百分比、Foxp3 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of Treg percentage and Foxp3 mRNA relative expression between 2 groups（±s）

表1 兩組外周血Treg 百分比、Foxp3 mRNA 相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of Treg percentage and Foxp3 mRNA relative expression between 2 groups（±s）

組別對照組肺癌組t 值P 值Treg 5.36±2.85 7.71±2.83 7.385 0.013 Foxp3 mRNA 1.38±0.71 2.59±0.86 22.367＜0.001

圖1 外周血Treg 檢測流式細胞圖Figure 1 Flow cytometry of Treg detection in peripheral blood

2.2 肺癌組放療期間外周血的檢測指標變化

肺癌組放療期間各階段外周血Treg 占CD4+T淋巴細胞百分比自放療后開始上升，至第18 次升至最高，與放療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），然后逐漸下降，至第30 次與放療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。肺癌組放療期間各階段外周血Foxp3mRNA 相對表達量自放療后開始上升，至第12 次升至最高，與放療前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），然后逐漸下降，至第30 次與放療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 肺癌放療各階段Treg、Foxp3 mRNA 的變化（±s）Table 2 Changes of Treg and Foxp3 mRNA in different stages of lung cancer radiotherapy（±s）

表2 肺癌放療各階段Treg、Foxp3 mRNA 的變化（±s）Table 2 Changes of Treg and Foxp3 mRNA in different stages of lung cancer radiotherapy（±s）

注：a與放療前相比，P<0.05。

分組放療前放療第6 次放療第12 次放療第18 次放療第24 次放療第30 次F 值P 值Treg 7.71±2.83 8.23±2.65 8.28±2.15 9.31±2.28a 9.18±3.06a 8.09±3.19 8.581<0.001 Foxp3 mRNA 2.59±0.84 3.07±0.89 3.25±1.00a 3.19±0.96a 3.10±0.92a 2.45±0.71 21.786<0.001

3 討論

我國肺癌的發(fā)病率和病死率均位居惡性腫瘤之首，并以NSCLC 最為多見［5］。由于肺癌早期診斷較為困難，確診時只有15%的患者能夠手術(shù)治療［5］。對于無法手術(shù)的患者，放療是主要的治療措施。放療可直接殺死腫瘤細胞，并通過刺激局部免疫反應(yīng)形成長期抗腫瘤效果［6］。然而，放療在激活抗腫瘤免疫的同時，也能引起機體的免疫抑制，造成腫瘤對射線的抵抗，這種現(xiàn)象與免疫抑制性Treg 的調(diào)控密切相關(guān)［2-3，7］。

本研究的結(jié)果表明，肺癌組放療前外周血Treg占CD4+T 淋巴細胞百分比及Foxp3mRNA 的相對表達水平均明顯升高，這種現(xiàn)象在其它的惡性腫瘤中也得到證實［8-9］，但Treg 占CD4+T 淋巴細胞百分比以及Foxp3 mRNA 相對表達水平增多的機制并未具體闡明。有研究表明腫瘤細胞高表達環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase-2，COX-2），COX-2 可產(chǎn)生過量的諾前列酮，從而誘導(dǎo)Treg 的產(chǎn)生，同時還可促進Foxp3 mRNA 表達的上調(diào)［10］。另外，腫瘤微環(huán)境中增多的白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及未成熟抗原遞呈細胞表達，可誘導(dǎo)Treg 的增殖［11］。Treg 可以通過細胞-細胞間的接觸抑制、細胞因子途徑兩種途徑抑制效應(yīng)細胞的免疫反應(yīng)，抑制機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。因此，腫瘤機體內(nèi)Treg 增多導(dǎo)致免疫耐受增強，加速腫瘤的進展［12］。

本研究結(jié)果顯示，肺癌放療過程中Treg 占CD4+T 淋巴細胞百分比以及Foxp3 mRNA 的相對表達量自放療后開始逐漸上升，這與Zhang 等［3，13］的研究結(jié)論是一致的。放療過程中Treg 升高的具體分子機制可能與放療能夠誘導(dǎo)和活化免疫抑制因子TGF-β、增加蛋白激酶B 的表達，進而促進Treg 生成、抑制Treg 凋亡有關(guān)［14］。Treg 和Foxp3 mRNA 升高至一定程度后又逐漸下降，這與Napolitano 等［15］在大腸癌中的研究一致，這種變化機制可能與microR-545 的表達有關(guān)。放療期間Treg 及Foxp3 mRNA 變化，提示放療進一步影響了機體的免疫耐受。

本研究探討了機體內(nèi)Treg 及Foxp3 mRNA 伴隨放療發(fā)生變化的現(xiàn)象及可能的機制。本研究亦存在一定的局限性：由于受嚴格的納入和排除標準限制，首診且僅行放療的患者較少，致入組的樣本量少，未按照腫瘤分期進行分組統(tǒng)計；另外，免疫系統(tǒng)的個體差異因素可能導(dǎo)致一定的偏倚。針對于上述問題，本課題組下一步的研究計劃將納入更多的患者，并對他們進行更長放療時間的追蹤，更精準地提煉出放療過程中Treg 以及Foxp3mRNA 的變化規(guī)律，并對內(nèi)部分子機制進行更深入的的研究。

放療協(xié)同免疫治療，應(yīng)用前景廣闊，研究肺癌放療過程中Treg 及其Foxp3mRNA 的普遍變化規(guī)律具有重要意義。如能在放療過程中選擇適宜的時機干擾Treg 或Foxp3mRNA 的表達，將充分發(fā)揮抗腫瘤免疫效應(yīng)細胞的功能，殺滅腫瘤細胞，提高肺癌放療的療效，改善患者的預(yù)后。