熒光PCR檢測高血壓用藥相關基因多態性方法的建立

劉秀卿 李延武 黃磊

藥物代謝的遺傳差異和藥物作用靶點如受體的遺傳多態性是影響個體對藥物反應的主要因素。已明確與高血壓藥物治療顯著相關的基因主要包括CYP2D6、CYP2C9、ADRB1、AGTR1、ACE等藥物代謝酶及其受體［1-4］。其中在中國人群中有多態性意義的基因突變，包括CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）等［5-7］。目前高血壓用藥基因檢測主要有四種方法：測序、PCR-RFLP、基因芯片和PCR-熔解曲線。前三者操作繁瑣，費時費力，難以滿足臨床常規檢測需求，而PCR-熔解曲線的特異性及結果判斷的簡易程度不及熒光PCR。熒光PCR 具有高靈敏性、高特異性、操作簡便、結果判斷簡單等特點，便于臨床常規檢測。本研究旨在建立一種簡單、準確的熒光PCR 法，檢測CYP2D6*10、CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）、ACE（I/D）位點的多態性，為高血壓藥物臨床使用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源

收集2017年6月至2019年1月本院EDTA-K2抗凝全血樣本362 份（含高血壓93 例）。納入標準：已完成高血壓基因芯片檢測的住院患者。排除標準：①既往有精神病、血液病、腫瘤病史患者；②無法完成檢測的樣本；③所有患者彼此無親緣關系。經深圳市第二人民醫院倫理委員會批準，使用已完成檢測的剩余樣本，故豁免知情同意。

1.1.2 試劑和主要儀器

深圳菲鵬10×Taq buffer（Mg2+plus）、25 mmol/L dNTP（含dUTP）、HS-Taq Ex（5 U/μL）、UNG 酶、江蘇康為世紀核酸提取試劑（50326）、湖南宏灝高血壓基因芯片檢測試劑（201811001）；深圳亞能YN-16 雜交儀、美國美谷Genepix 4100A 生物芯片掃描儀、杭州博日FQD-96A 熒光PCR 儀、德國Implen P-330-31 超微量分光光度計。

1.2 方法

提取標本DNA 置-70℃冰箱保存待用。引物探針設計 用Primer Premier 5.0 及Primer Express 3.0 軟件設計引物和探針組。見表1。

表1 引物和探針Table 1 Primers and probes

PCR 擴增產物送至賽默飛世爾科技廣州測序中心進行雙向序列測定。基因芯片檢測操作參照儀器和試劑說明書。

熒光PCR反應：分5管進行。反應體系20 μL，包括Taq Buffer 2 μL，HS-Taq Ex 0.2 μL，UNG 酶0.05 μL，dNTP2 μL，10 μmol/L 引物對及探針各0.2 μL；DNA 1.5 μL，ddH2O 13.45 μL。循環參數：37℃10 min；95℃5 min；95℃15 s，60℃30 s，共40 個循環，在延伸階段60℃收集熒光信號。見表2。

表2 熒光PCR 結果判讀Table 2 Results interpretation of fluorescence PCR

性能評價：檢出限：將各位點H 型、W 型、M 型的核酸用TE 緩沖液分別稀釋至50、30、20、10 和5 ng/μL，用熒光PCR 檢測3 次，型別正確即符合。重復性：稀釋至20 ng/μL 分3 批檢測，每批檢測8次，計算FAM 和VIC 通道Ct 平均值、標準差和變異系數，CV<5%為合格。抗干擾能力：分別加入3 200 mg/dL 甘油三酯、200 g/dL 血紅蛋白、150 mg/dL 膽紅素、2 倍治療濃度的高血壓常用藥物，共90 個樣本。提取后檢測。臨床樣本檢測及準確度：用三種方法分別檢測362 例樣本。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 數據分析；采用四格表分析，與基因芯片法相比，評價熒光PCR 法的符合率、特異性并進行配對卡方檢驗；與測序法相比，評價熒光PCR 法的符合率、準確性并進行配對卡方檢驗；以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 檢出限

結果顯示20 ng/μL 的樣本3 次檢測均型別正確。CYP2C9*35 ng/μL 和ADRB1（1165G>C）10 ng/μL H 型樣本FAM 通道均只有2 次有擴增；ACE（I/D）10 ng/μL H 型樣本FAM 和VIC 通道都只有2 次有擴增。見圖1。

圖1 熒光PCR 檢測結果Figure 1 The results real-time PCR

2.2 重復性

H 型、W 型、M 型批內差及批間差均小于5%。見表3。

表3 重復性檢測結果（%）Table 3 Repeatability test results（%）

2.3 抗干擾能力

所有加入干擾物質的樣本檢測CT 值與原始樣本CT 值的差值均在1 個CT 值以內。見表4。

表4 抗干擾能力檢測結果Table 4 Test results of anti-interference ability

2.4 臨床樣本驗證與準確性

其中有5 例CYP2D6*10熒光PCR 為W 型而基因芯片為H 型，另各1 例熒光PCR 為H 型和M型而基因芯片為M 型和H 型；還有3 例ACE（I/D）熒光PCR 為W 型而基因芯片為H 型；熒光PCR 基因分型與測序結果完全一致，符合率100%，見表5。各位點測序圖見圖2。362 例樣本分高血壓和非高血壓組，基因型分布。見表6。

表5 3 種檢測方法檢測結果對比分析Table 5 Comparative Analysis of the results of three detection methods

表6 高血壓組和非高血壓組各基因分布Table 6 Distribution of genes in hypertension group and non hypertension group

3 討論

CYP2D6*10多態性可影響美托洛爾、卡維地洛等藥物在體內的代謝過程［8］；CYP2C9*3能降低依貝沙坦、甲苯磺丁脲等藥物的體內清除率［1］；ADRB1是β1 腎上腺素受體類藥物的作用靶點，會影響藥物療效；AGTR1（1166A>C）能影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統抑制劑類藥物的療效［9］；ACE（I/D）能影響ACE 抑制劑和β 受體拮抗劑類藥物的效應［10-11］。基因檢測能讓醫生了解患者對不同降壓藥物的療效反應及毒性，更好地進行個性化治療。因此臨床急需建立一種快速簡便可以聯合檢測高血壓用藥相關基因的方法。

熒光PCR 法對362 例臨床樣本進行檢測，總體CYP2C9*3、ADRB1（1165G>C）、AGTR1（1166A>C）的基因型分布與張欣然等人的文獻報道一致［12］；而CYP2D6*10和ACE（I/D）的基因型分布與趙杰娉等人的報道不太一致［13］，這與選取特定樣本的分組有關。本實驗結果與李俊萍［14］等對石家莊漢族人群的ADRB1基因多態性研究結果相一致，這提示ADRB1基因中C 等位基因有可能是高血壓的易感基因。

熒光PCR 檢測CYP2C9*3、ADRB1 和AGTR1與基因芯片100%符合，CYP2D6*10、ACE的基因型符合率分別是98.07%、99.17%，檢測結果無統計學差異。以Sanger 測序為金標準，熒光PCR 法的準確性、特異性、敏感性均為100%，證實了熒光PCR 法的準確性高于基因芯片法。準確熒光定點、合理調節芯片亮度與對比度以及正確設立判定參數，均會影響基因芯片結果判定。此外，ACE 3 例插入型基因芯片為雜合型，可能由于插入型和缺失型有一段高度相似的序列導致；CYP2D6*10有7 例基因芯片與測序不一致，也可能CYP2D6*1/*10存在小概率突變［15］。熒光PCR 亦證實CYP2D6雜合子分型中C∶T 存在1∶1、1∶2、1∶3 的現象，但VIC 信號值不會低于FAM 1/2。無論是Sanger 測序、基因芯片還是熒光PCR，前期處理大致相同，前二者需后處理費時費力，而熒光PCR 操作簡單、準確率高、特異性強、重復性好、省時快速且結果判讀容易，能更好的服務病人與臨床。當然熒光PCR 也有局限性，只可檢測已知的SNP 位點而不能發現未知的SNP 位點［16］。

綜上所述，熒光PCR 法能夠快速準確對患者高血壓相關的功能意義明確且發生頻率較高的基因突變進行分型，如果能夠擴大樣本量并且進行多中心臨床驗證，它將具有廣闊的應用前景。

圖2 測序結果Figure 2 Sequencing results