TIF1-γ重組蛋白的表達及其在抗TIF1-γ抗體ELISA檢測方法中的初步應用

韓冠華 林曉濤 孟慶勇 何林 錢純亙 程邦寧★ 徐軍發★

特發性炎性肌病（idiopathic inflammatory my-opathy，IIM）是一組以對稱性四肢近端肌無力為特征表現的系統性自身免疫性結締組織病，基于臨床癥狀及免疫病理特征，可將其分為不同的亞型，臨床上常見的亞型是皮肌炎（dermatomyositis，DM）。隨著研究的深入，陸續有學者發現IIM 患者血清中存在特異性的自身抗體，且此類抗體與IIM 患者的臨床表現和預后相關，有助于指導臨床醫生為患者制定個體化的治療方案［1-2］。其中抗轉錄中介因子1-γ（TranscriptionalIntermediary Factor 1-gamma，TIF1-γ）抗體是TARGOFF 等［3］于2006年通過免疫沉淀法（immunoprecipitation，IP）首次在肌炎患者血清中發現的一種自身抗體，后續的多項研究指出抗TIF1-γ 抗體可作為監測DM 患者繼發惡性腫瘤的生物標志物［4］。檢測抗TIF1-γ 抗體的金標準是IP，但由于該方法涉及培養及使用細胞，步驟繁瑣，且需要使用放射性標記物，并不適用于臨床檢測。目前臨床上檢測抗TIF1-γ 抗體最常用的是抗肌炎抗體譜IgG 檢測試劑盒（歐蒙印跡法），但基于不同方法學之間特異性和敏感度會存在一定差異，應結合臨床癥狀和其它檢測方法（如ELISA、化學發光法等）對檢測結果進行綜合分析［5-6］?；谏鲜霰尘?，本研究將分析TIF1-γ 重組蛋白作為診斷抗原的臨床應用價值，為開發抗TIF1-γ IgG 抗體檢測方法提供核心原料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

DH10Bac 感受態細胞、SF9 細胞由本實驗室保存；質粒提取試劑盒、脂質體轉染試劑盒購自Ther-mo 公司；Flag 層析填料購自MBL 公司；抗Flag 標簽鼠單克隆抗體購自康為世紀生物科技有限公司；封閉液、偶聯物穩定劑、TMB 底物購自湖州英創生物科技有限公司；鼠抗人IgG-HRP 購自菲鵬生物股份有限公司；PCR 儀、酶標儀為BioRad 公司產品。

1.1.2 標本來源

抗TIF1-γ IgG 抗體陽性血清21 例，抗Jo-1 IgG 抗體、抗Scl-70IgG 抗體、抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體、類風濕因子（RF）和抗核抗體（ANA）各5 例，共25 例（疾病對照組）以及健康體檢者血清44 例（健康對照組），由本實驗室收集并保存，均已分離血清并保存在-80℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 表達質粒pFastBac1-TIF1-γ 的構建

從Uniprot 數據庫檢索得到人TIF1-γ 氨基酸序列（ID：Q9UPN9），按照昆蟲桿狀病毒表達系統偏好對TIF1-γ 序列進行密碼子優化，在C-端同時引入3×Flag 序列，委托通用生物系統（安徽）有限公司合成。合成的TIF1-γ 基因為3 462 bp，其中5′端含BamHI 酶切位點，3′端含XhoI 酶切位點，經BamHI和XhoI 雙酶切后插入到pFastBac1 載體，表達質粒經測序及雙酶切鑒定確認構建的正確性。

1.2.2 TIF1-γ 重組蛋白的表達與純化

將pFastBac1-TIF1-γ 轉化DH10Bac 感受態細胞，使用LB 瓊脂平板（含50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四環素、7 μg/mL 慶大霉素、100 μg/mL X-gal 和40 μg/mL IPTG）進行藍白斑篩選，分別挑取藍斑和白斑擴大培養，培養物用于提取重組桿粒，具體操作參考質粒提取試劑盒說明書。使用M13 Forward/M13 Reverse 引物對重組桿粒進行PCR 鑒定。將鑒定正確的Bacmid-TIF1-γ 轉染至SF9 細胞，27℃培養72 h，500 g 離心15 min 收集上清即為第一代重組病毒（P1）；P1 用于感染正常SF9 細胞，擴增病毒得到P2；通過相同的方法得到P3，將P3 加入到懸浮培養的SF9 細胞，27℃，110 rpm 培養72 h，收獲細胞并進行離心和超聲處理，收集細胞裂解液，通過Flag 親和層析柱進行純化，收集表達產物進行SDS-PAGE 和Western-Blot 分析。

1.2.3 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 的建立

TIF1-γ 重組蛋白包被96 孔板（400 ng/孔），商品化封閉液封閉；血清按1∶100 稀釋，每孔100 μL，37℃孵育1 h；PBS-T 洗板3 次后加入1∶10 000稀釋的HRP 標記的鼠抗人IgG，100 μL 每孔，37℃孵育30 min；再次清洗后，加入TMB 底物，37℃孵育10 min；最后加入終止液，酶標儀讀取OD 值。

1.2.4 統計學處理

使用SPSS 26.0 統計分析軟件對數據進行處理，通過繪制受試者工作特征曲線（receiver opera-tion characteristic，ROC），確定自建抗TIF1-γ IgG抗體-ELISA 檢測臨界（cut-off）值。

2 結果

2.1 表達質粒pFastBac1-TIF1-γ 的構建及鑒定

電泳結果顯示出現兩條特異性條帶，其中一條位置約在3 400 bp 處為TIF1-γ 基因，另一條位置約在4 700 bp 處為載體pFastBac1。見圖1。

圖1 pFastBac1-TIF1-γ 雙酶切鑒定結果Figure 1 Restriction enzyme identification of pFastBac1-TIF1-γ

2.2 重組桿粒Bacmid-TIF1-γ 的鑒定

已發生轉座的Bacmid- TIF1-γ 條帶位置約在5 700 bp 處，未發生轉座的Bacmid 條帶位置約在300 bp 處。見圖2。

圖2 Bacmid-TIF1-γ 擴增結果Figure 2 PCR result of the Bacmid-TIF1-γ

2.3 TIF1-γ 重組蛋白表達和純化

表達產物經SDS-PAGE 分析，目的蛋白條帶位置約在150 kD 處。Western-Blot 結果顯示，該目的條帶能與抗Flag 標簽抗體特異性結合。見圖3～4。

圖3 表達產物的SDS-PAGE 分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of expression protein products

圖4 TIF1-γ 重組蛋白Western-Blot 檢測Figure 4 The detection of TIF1-γ recombinant protein by Western Blot

2.4 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 檢測結果

結果顯示，OD 值=0.273 時約登指數最大，因此把cut-off 值選定為0.273，此時敏感度為100%，特異性為97.1%。見圖5。

圖5 抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA ROC 曲線Figure 5 ROC curve of anti-TIF1-γ antibody-ELISA

3 討論

TIF1-γ 蛋白屬于TRIMs（Tripartite motif-con-taining）家族蛋白，具有一個RING 結構域，可作為泛素連接酶E3 發揮作用，在腫瘤發生過程中扮演著重要的角色，如參與凋亡相關蛋白P53 的調控、抑制TGF-β 信號通路的活性等，推測這些蛋白的自身抗體可能是腫瘤發生過程中產生的，從而促進癌癥的發生［7-8］?？筎IF1-γ 抗體可作為監測IIM 患者繼發惡性腫瘤的生物標志物。臨床上對于抗TIF1-γ 抗體陽性的IIM 患者，應注意密切隨訪，及時進行相關的腫瘤檢測。IP 被視為檢測該類自身抗體的金標準，但它并不適用于常規的臨床檢測，面對不斷增長的患者數量，建立有效、可靠、快速和簡便的抗TIF1-γ 抗體檢測方法非常有必要。為了驗證現有試劑的性能以及開發出更符合臨床需求的抗TIF1-γ 抗體檢測試劑，Aggarwal 等［9］以OriGene 公司的純化全長TIF1-γ重組蛋白作為包被抗原建立了基于ELISA 的抗TIF1-γ 抗體的檢測方法與IP 進行比較，總體符合率為93.9%，有高度的一致性（κ=0.87）。Mahler 等［10］用歐蒙印跡法與IP 共同測試一批DM 患者血清，其中抗TIF1-γ 抗體項目總體符合率為94.9%，κ=0.71（P<0.05），一致性較好。上述研究表明，以歐蒙抗肌炎抗體譜IgG 檢測試劑盒為代表的IB 檢測方法與金標準IP 有較好的一致性，同樣的，以ELISA 為原理所建立的檢測方法也有望替代IP。

本研究測試過程中發現2 例與歐蒙印跡法測試結果不符的樣本，推測出現不符的原因有以下幾點，一是包被抗原的純度。本研究得到的重組蛋白經純化后通過SDS-PAGE 分析，存在較明顯的非目的條帶，猜測是目的蛋白降解產物，是否因此而產生了非特異性結合還有待驗證。二是固相載體材料的不同。ELISA 和IB 的固相材料分別為聚苯乙烯和硝酸素纖維膜，因此包被工藝可能會存在差異。如將蛋白包被在硝酸素纖維膜后，一般需要進行一定時間的烘干，此過程對蛋白的活性可能會造成一定的影響，而蛋白質與酶標板的結合則是通過物理吸附作用，包被條件相對溫和。三是反應體系的不同。封閉液和緩沖液的選擇，如鹽離子的濃度、表面活性劑的種類及用量、是否需要添加額外的蛋白成分或阻斷劑等都有可能對測試結果產生影響。四是不同方法學之間特異性和敏感度會存在一定差異，且抗TIF1-γ IgG 抗體的檢測目前沒有可溯源的國際標準品，對于測試結果有存在爭議的樣本，應參考不同技術平臺的檢測結果并結合患者臨床表現進行綜合分析［11-12］。綜合上述四個方面，后續需通過金標準或第三方ELISA 試劑驗證兩例假陽性樣本是否為“真陰性”。另外有文獻報道，兩種自身抗體各自對應的靶抗原（Mi-2β 和TIF1-γ）有相似的氨基酸序列，抗Mi-2β 抗體會和TIF1-γ 蛋白結合，出現交叉反應［13］。后續仍需收集并測試更多疾病對照組樣本，探討是否存在能與本研究制備的TIF1-γ 重組蛋白結合的自身抗體，進一步評估自建ELISA 的特異性。綜上所述，本研究得到的TIF1-γ 重組蛋白在體外診斷試劑研發方面具有較好的應用前景，為開發抗TIF1-γ IgG 抗體檢測方法提供了核心原料?；诖酥亟M蛋白初步建立的抗TIF1-γ IgG 抗體-ELISA 是一種特異和靈敏的血清學檢測方法，對臨床診斷和治療皮肌炎患者有一定的應用價值，可作為現有免疫印跡法試劑的良好補充。