近紅外誘導PLGA納米粒子用于US/MR成像和乳腺癌治療

左鳳梅 盧佳慧 劉雅文 倪晨 時梅林 胡俊峰

近年來，以多功能納米顆粒為基礎，將診斷與治療整合為一個系統，可以提高臨床療效，減少治療的副作用，為癌癥的精確診療提供了新的思路［1-3］。目前，乳腺癌的治療包括手術切除、化療、放療等［4-6］。然而，這些方法也會對健康組織造成嚴重損害。因此，一種新型的腫瘤治療方法-光熱療法（Photothermal therapy，PTT）被提出［7］。PTT療法是利用光敏劑將光轉化為熱，在激發光照射下，腫瘤部分迅速升溫殺傷腫瘤細胞［8］。本研究使用吲哚菁綠（Indocyanine green，ICG）作為光敏劑，ICG 是一種近紅外熒光染料，在激光照射后具有良好的光熱轉換效率和較高的生物安全性，但游離情況下穩定性差，血液循環壽命短。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

透射電子顯微鏡（Tecnai G2 F20，美國），馬爾文粒徑分析儀（Nano ZS90，英國），紫外分光光度計（Uvmini-1240，日本），808 激光儀（MDL-N-808-8W，中國），多功能酶標儀（Biotek，美國），超聲波破碎儀（JY92-IIDN，中國），超聲成像儀（Philip，荷蘭），熒光倒置顯微鏡（DMI3000B，美國），3.0T磁共振成像設備（GE Discovery 750w，美國）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，分子量10 000，聚合比50∶50，Evonik，德國），氯化錳（Manganese（II）chloride，MnCl2，北陸藥業，中國），全氟戊烷（Perfluoropen-tane，PFP，阿拉丁，中國），吲哚菁綠（ICG，麥克林，中國），聚乙烯醇（PVA，Sigma，美國）；MDA-MB-231，NIH-3T3 細胞株（中科院上海細胞庫，中國），細胞計數試劑盒（CCK-8，美侖，中國）。

1.2 PMINPs 的制備

將100 mg 的PLGA 加入4 mL 的二氯甲烷，待充分溶解后加入200 μL 的PFP，2 mg ICG，200 μL MnCl2冰浴下超聲破碎2 min 分鐘（100 W），得到的初乳液緩慢滴入20 mL 2%PVA 溶液，超聲破碎5 min（50 W）制成復乳，冰浴下攪拌8 h 揮發二氯甲烷，轉速10 000 r/min 洗滌離心，重復三次后凍干備用，制備全程避光低溫。

1.3 PMINPs 一般性質檢測

使用透射電子顯微鏡觀察材料的形貌和結構；使用馬爾文粒徑儀分析PMINPs 的粒徑大小、PDI 及電位。采用紫外分光光度法計算ICG 的標準曲線，根據標準曲線來計算PMINPs 中ICG 的包封率。

1.4 細胞毒性檢測和PMINPs 的攝入

MDA-MB-231 和NIH-3T3 細胞在96 孔板中孵育，37℃條件下，每孔培養1×104個細胞，孵育12 h。實驗組每孔加入100 μL 含有不同濃度PMINPs 的培養基。孵育6 h，采用細胞計數試劑盒（CCK-8）檢測PMINPs 的細胞毒性。將熒光標記物香豆素-6 裝入PMINPs 中，細胞孵育1、2、3 h 后，采用DAPI（4′，6-diamidino-2-phenylindole）對細胞核進行染色，制片后使用倒置熒光顯微鏡進行觀察。

1.5 光熱性能檢測

給予808 nm 激光輻照（1.5 w/cm2，5 min），用紅外熱成像儀記錄各組溫度變化。隨后游離的ICG 和PMINPs 根據ICG 濃度配制成25 μg/mL 的溶液，取100 μL 置于96 孔板中，由808 nm 激光開-關循環輻照重復4 次（開1 min，關2 min），用紅外熱成像儀記錄各組溫度變化。

取對數生長期的MDA-MB-231 細胞與材料孵育6 h 后分組處理，用CCK-8 評價各組的細胞毒性。材料與細胞孵育6 h 后處理四個分組，激光照射后分別用鈣黃綠素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）處理細胞，采用活死細胞染色法定性考察光熱效果。

1.6 超聲/磁共振雙模成像

1.6.1 超聲（Ultrasound，US）

顯微鏡下觀察激光照射（1.5 w/cm2）下PMINPs的變化。將軟管浸入水中，采用808 激光照射（1.5 w/cm2），使用超聲成像儀觀察是否成像。

1.6.2 磁共振（Magnetic Resonance，MR）

在3.0 T Discovery 750 W MR系統上對PMINPs進行T1 加權成像研究。用自旋回波序列對稀釋后的樣品進行MRI 掃描。此外，利用MDA-MB-231細胞的體外MR 成像試驗評價其對乳腺癌細胞的磁共振成像能力。MDA-MB-231 細胞與不同濃度PMINPs 孵育6 h。將細胞消化離心收集并用PBS洗滌，使用前面描述的磁共振成像系統進行磁共振成像。磁共振掃描參數：重復時間=16 ms，回波時間=3.2 ms，視野=8 cm×8 cm，層厚=0.4 mm，層間距=0.5 mm，矩陣=320×288。

1.7 統計學分析

采用IBM SPSS Statistics 24 軟件處理分析數據，計量資料以（）形式表示，采用t檢驗和單因素方差分析，以P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PMINPs 一般性質

所制備的納米粒子具有明顯的核/殼結構，粒徑均勻，分散性強（圖1A）。如圖1B 所示，PMINPs的尺寸為（211.10±2.66）nm，PDI 為0.12。Zeta 電位為（-17.50±0.65）mV。圖1C 中可以看出，PFP/MnCl2@PLGA NPs 的吸收光譜沒有明顯的吸收峰，而自由ICG 的吸收光譜在770～790 nm 左右達到峰值。PMINPs 的吸收光譜在790～810 nm 處出現峰值通過紫外吸收光譜確定ICG 標準曲線為y=0.247 5x-0.072 5（r=0.999）（圖1D）。在此基礎上計算ICG 的平均包封率為（76.38±0.32）%，平均載藥量為（6.99±3.98）%。

圖1 PMINPs 的表征Figure 1 Characterizations of PMINPs

2.2 細胞毒性檢測和攝入

CCK-8試驗結果顯示當濃度到達160 μg/mL時，PMINPs 對MDA-MB-231和NIH-3T3細胞均無明顯細胞毒性，不同濃度吸光度值差異無統計學意義，且細胞活力都在90%以上（圖2A）。從圖2B 中可以看出，隨著時間的推移，MDA-MB-231細胞中出現代表PMINPs的綠色熒光且隨著時間的增加而變量。

圖2 PMINPs 的體外細胞毒性和細胞攝取Figure 2 In vitro cytotoxicity and cellular uptake of PMINPs

2.3 光熱性能檢測

經過808 nm 激光輻照后，PMINPs 升溫顯著，與ICG 的濃度呈正相關（圖3A）。經過4 個激光開-關循環后，PMINPs 仍可以較穩定的產熱，升溫峰值只降低了3.3℃，而游離ICG 產熱能力則明顯下降關（圖3B）。

如圖3C 所示，不同濃度的PMINPs 在沒有激光照射的情況下細胞活性沒有明顯下降。在近紅外激光照射下，隨著PMINPs 濃度的增加，癌細胞的消融作用增強。對于PFP/MnCl2@PLGA NPs，由于光敏劑ICG 的缺乏，激光照射后的加熱效果不明顯，對腫瘤細胞的損傷也很難觀察到。如圖3D 所示，僅激光照射，PMINPs 處理對細胞無明顯殺傷作用。

圖3 PMINPs 光熱性能檢測Figure 3 PMINPs photothermal performance test

2.4 超聲/磁共振雙模成像

2.4.1 超聲

隨著輻照時間的延長，微泡膨脹到一定體積后開始破裂（圖4A）。相應的，在808 nm 近紅外激光照射前，透明塑膠軟管中PMINPs 的超聲成像效果沒有增強。當激光照射后，PFP 氣化，產生氣泡，并發生明顯的超聲成像增強（圖4B）。

圖4 超聲成像Figure 4 US imaging

2.4.2 磁共振

PMINPs 的磁共振信號強度隨著Mn 濃度的增加而增強，見圖5A。PMINPs 在細胞中具有很好的磁共振成像能力，并且是濃度依賴性的，見圖5B。

圖5 磁共振成像Figure 5 MR imaging

3 討論

根據已有研究可知，錳離子可以增強T1 信號，能顯著提高病灶與周圍良性組織的對比度。本研究中選用MnCl2作為磁共振造影劑。制備的納米粒子將MnCl2包裹在內，由于MnCl2將會隨著納米載體在機體血液及組織內流通循環，會大大提高其在機體內的循環時間，從而給磁共振成像診斷提供充足的時間。磁共振成像是一種具有精細軟組織對比和多平面成像能力的無創成像工具，但通常需要較長的采集時間，不能提供實時圖像［9］。相比之下，超聲可以提供實時圖像，但在組織識別方面能力與磁共振相比略差［10］。在許多臨床應用中，超聲和磁共振是互補的，以區別可能的病理改變組織［11］。已有許多前人開發了相應造影劑，可以達到超聲/磁共振共同成像的目的［12-13］。在這項工作中，筆者用了第三代造影劑全氟戊烷，在室溫下以液體形式存在，而在注射進入人體以后，當達到相變溫度，發生液氣相變變為氣態，達到超聲顯影增強目的［14］。

所研制的納米粒子具有粒徑適宜、穩定性高的特點。粒徑在200 nm 左右的PMINPs 可通過實體瘤的高通透性和滯留效應在腫瘤部位富集。因此，在近紅外激光照射下，富集在腫瘤部位的光敏劑ICG 迅速升溫殺傷腫瘤而對正常組織的殺傷作用較小。重要的是，由于溫度迅速上升，PFP 轉變為氣泡增強超聲成像。同時，納米顆粒釋放出MnCl2，其體積小，可以更好地穿透腫瘤，獲得更均勻的磁共振成像結果。通過一系列的表征，證實PMINPs具有良好的腫瘤吸收能力，可用于乳腺癌超聲/磁共振雙模成像及治療。在以后的研究工作中，還有以下幾個方面的工作需要完善：可嘗試在納米微球表面修飾靶向物如適配體，葉酸等，增加其靶向性；進一步研究納米微球在動物體內的成像與治療效果等，為臨床應用奠定試驗基礎。