孕婦VDR基因Fok I位點(diǎn)多態(tài)性與臍血25-羥維生素D的關(guān)系研究

陳楊萍 徐峰 林蒙蒙 戴曉曉 胡曉霞 張燁

佝僂病是嚴(yán)重影響兒童骨骼發(fā)育的疾病之一，大多是由體內(nèi)維生素D缺乏或不足引起鈣、磷代謝紊亂，造成鈣鹽在骨骼生長的過程中無法正常沉著，從而導(dǎo)致成年后出現(xiàn)骨痛、骨折及骨骼畸形的慢性營養(yǎng)缺乏性疾病。目前研究較多的是胎兒出生后的骨骼發(fā)育，較少關(guān)注胎兒期的骨骼發(fā)育情況。新生兒佝僂病是指在新生兒期發(fā)生的鈣、磷和（或）維生素D缺乏引起的鈣磷代謝失常，造成生長中的骨樣組織過多積聚和（或）骨骼基質(zhì)鈣鹽沉著障礙的代謝性骨病，有一部分新生兒在出生時(shí)就發(fā)生，即稱為先天性佝僂病，在我國目前并不少見，一旦錯(cuò)失最佳的治療時(shí)機(jī)，就會(huì)發(fā)生不可逆的骨骼畸形。孕母25-羥維生D水平是新生兒體內(nèi)維生素D儲(chǔ)備的主要來源[1]，孕母維生素D不足可引起新生兒骨骼鈣化不良、生長發(fā)育遲緩及先天性佝僂病[2]。研究表明維生素D受體（vitamin D receptor,VDR）基因多態(tài)性與維生素D缺乏性佝僂病[3]、小鼠子代骨骼發(fā)育不良[4]及兒童呼吸系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病[5]的發(fā)生相關(guān)。Yasovanthi等[6]的研究提示VDR基因Fok I位點(diǎn)與低骨量、骨質(zhì)疏松及佝僂病有一定的相關(guān)性。本研究旨在分析孕婦VDR基因Fok I多態(tài)性與臍血25-羥維生素D水平的關(guān)系，以期為預(yù)防新生兒先天性佝僂病提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年6月至2019年5月在溫州市中心醫(yī)院產(chǎn)檢的846例孕婦為研究對(duì)象，均為單胎。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有參加本研究的孕婦均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 于孕早期測量孕婦身高、體重、BMI，設(shè)計(jì)問卷調(diào)查表，排除妊娠期糖尿病、高血壓病、風(fēng)濕免疫性疾病、染色體異常、甲狀腺異常及骨代謝異常相關(guān)疾病。記錄孕婦孕期服用鈣量及維生素D3、腓腸肌痙攣等情況。研究者查詢不同品牌鈣補(bǔ)充劑的劑量，根據(jù)說明書含量轉(zhuǎn)換為孕期補(bǔ)充維生素D3含量（單位為U）和鈣劑含量（單位為 mg），記錄新生兒出生時(shí)的基本情況。

1.2.2 孕婦VDR基因Fok I多態(tài)性及25-羥維生素D水平檢測 孕晚期檢測孕婦血液中VDR基因Fok I多態(tài)性，采用PCR-焦磷酸遺傳分析技術(shù)。（1）提?。菏褂瞄L沙三濟(jì)生物科技有限公司全血DNA基因提取試劑盒提取患者血液中白細(xì)胞DNA，置于-20℃保存。（2）擴(kuò)增：反應(yīng)體系為25μl，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，共 45個(gè)循環(huán)。前引物：5'-GTGGCCTGCTTGCTGTTC-3'，后引物：5'-ACAGATCCGGGGCACGTT-3'， 測 序 引 物 ：5'-TTGCTGTTCTTACAGGG-3'。（3）焦磷酸測序：用 PyroMark Q24 測序儀（德國凱杰公司）隨機(jī)選擇10%樣本PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸基因測序，最后用PyroMark Q24 MDx Software查看測序結(jié)果。

1.2.3 25-羥維生素D水平檢測 取孕婦孕晚期靜脈血5 ml，新生兒出生斷臍后抽取臍靜脈血3 ml。置于惰性分離膠促凝管及快速血清管，3 000 g離心10 min，將血清標(biāo)本置于-80℃冰箱保存，并于48 h內(nèi)檢測25-羥維生素D水平。采用美國SHD公司生產(chǎn)的總維生素D測試試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件?；蛐图暗任换蚍植碱l率用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)[7]。計(jì)量資料以表示，多組比較用單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 為評(píng)價(jià)基因頻率估計(jì)的可靠性，對(duì)846例孕婦VDR基因Fok I位點(diǎn)的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示其等位基因的位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，說明該組孕婦在溫州地區(qū)孕婦人群中具有良好的代表性（χ2=1.27，P＞0.05）。

2.2 不同基因型孕婦基本情況比較 846例孕婦中，VDR基因Fok I位點(diǎn)TT基因型206例，占24.35%；TC基因型386例，占45.63%；CC基因型254例，占30.02%。3種不同基因型孕婦年齡、BMI、分娩孕周、服用鈣量和維生素D及戶外活動(dòng)時(shí)間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表 1。

表1 不同基因型孕婦的基本情況比較

2.3 不同基因型孕婦的新生兒出生基本情況比較 3種不同基因型孕婦的新生兒出生體重、性別、分娩方式比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 不同基因型孕婦的新生兒出生基本情況比較

2.4 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平、腓腸肌痙攣情況比較 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平、腓腸肌痙攣情況比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。兩兩比較，VDR基因Fok I位點(diǎn)TT型的孕婦血清及臍血25-羥維生素D水平＜TC型＜CC型（均P＜0.05），TT型和TC型均顯示25-羥維生素D水平不足；TT型孕婦的腓腸肌痙攣發(fā)生率亦較高（均P＜0.05），見表3。

表3 不同基因型孕婦血清及臍血25-羥維生素D濃度、腓腸肌痙攣比較

3 討論

維生素D是一種脂溶性開環(huán)固醇類物質(zhì)，包括植物來源的維生素D2和動(dòng)物來源的維生素D3，其在體內(nèi)經(jīng)25羥化酶作用下形成25-羥維生素D，再經(jīng)過1α位羥化成為 1,25（OH）2D3，通過與組織中廣泛存在的VDR結(jié)合，發(fā)揮激素樣作用。維生素D主要生理作用是促進(jìn)鈣和磷在腸道中吸收，并抑制甲狀旁腺素（parathyroid hormone,PTH）釋放，維持血鈣和磷水平正常，進(jìn)而保證骨骼正常礦化。有研究報(bào)道，維生素D還對(duì)代謝、免疫、腫瘤發(fā)生、妊娠和胎兒發(fā)育等方面也有一定的影響[8]。VDR基因位于染色體12q12-14上，有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子組成。VDR基因編碼的維生素D受體蛋白，能特異地結(jié)合1,25（OH）2D3，發(fā)揮調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞增生、分化及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響骨骼的發(fā)育。目前研究發(fā)現(xiàn)VDR基因多態(tài)性主要有4個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)對(duì)骨代謝有重要的影響，分別為Fok I、Bsm I、Apa I及 Taq I限制性酶切位點(diǎn)。Fok I限制性位點(diǎn)多態(tài)性位于2號(hào)外顯子，存在T/C轉(zhuǎn)換多態(tài)性，導(dǎo)致編碼氨基酸密碼子427ACG＞ATG突變，一般以等位基因F、f表示，f表示存在Fok I酶切位點(diǎn)，F(xiàn)表示缺乏Fok I酶切位點(diǎn)，兩者可有3種不同的組合（FF、Ff、ff或 CC、TC、TT）。葉侃等[9]的研究表明 Fok I 位點(diǎn)TT型基因型可能是佝僂病的遺傳學(xué)危險(xiǎn)因素。體內(nèi)維生素D的不足和缺乏可導(dǎo)致非特異性骨骼肌肉痛（non-specific musculosk-eletal pain,NSMP）、骨質(zhì)疏松、呼吸系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病及炎癥性腸病等。有研究報(bào)道，NSMP患者血清中25-羥維生素D大多數(shù)缺乏，疼痛程度與其血清25-羥維生素D水平為負(fù)相關(guān)[10]。25-羥維生素D因其性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期長，在血清中水平高，故可作為反應(yīng)體內(nèi)維生素D營養(yǎng)狀況的可靠指標(biāo)。2016年全球多學(xué)科專家共同制定的《全球營養(yǎng)性佝僂病防治共識(shí)》中規(guī)定維生素D狀況：充足為＞50 nmol/L（20 ng/ml）；不足為 30～50 nmol/L（12～20 ng/ml）；缺乏＜30 nmol/L（12 ng/ml）。據(jù)針對(duì)中國不同緯度城市的相關(guān)研究顯示，目前我國維生素D的缺乏或不足現(xiàn)象比較普遍[11-13]。維生素D是人體必須的營養(yǎng)物質(zhì)，通過陽光照射、經(jīng)口攝入和胎兒母體轉(zhuǎn)運(yùn)獲得。嬰幼兒作為一類特殊的群體，早期維生素D的需求主要通過臍帶轉(zhuǎn)運(yùn)來自孕母體內(nèi)的維生素D。Misra等[14]研究表明孕期維生素D的缺乏可導(dǎo)致新生兒佝僂病。

新生兒佝僂病主要是由于體內(nèi)維生素D缺乏而引起鈣磷代謝異常而導(dǎo)致的生長期骨礦化不全，產(chǎn)生以骨骼病變?yōu)樘卣鳎瑫r(shí)影響嬰幼兒神經(jīng)、肌肉、免疫功能的全身慢性營養(yǎng)性疾病。有學(xué)者研究表明新生兒期的代謝性骨病對(duì)兒童以后的身高有重要的遠(yuǎn)期影響[15]。95%的新生兒先天性佝僂病的原因是母體和新生兒體內(nèi)鈣劑、磷劑和維生素D的相對(duì)不足[16]。人類骨骼發(fā)育從胎兒期開始，胎兒期的骨骼發(fā)育所需80%的鈣都是在妊娠最后3個(gè)月從母體獲得的。孕母體內(nèi)維生素D的水平和新生兒出生時(shí)的胎齡可影響新生兒體內(nèi)的維生素D水平。1,25（OH）2D3是體內(nèi)維生素D的主要形式，而胎兒的1,25（OH）2D3完全由母體通過胎盤絨毛膜受血面提供的。因此孕母和新生兒臍血25-羥維生素D水平密切相關(guān)，有研究表明孕母體內(nèi)維生素D缺乏的嬰兒、早產(chǎn)或雙胎兒出生后其血清維生素D亦不足[17-19]。李雪香等[20]及池美珠等[21]的研究表明新生兒臍血25-羥維生素D水平與孕母外周血25-羥維生素D水平呈正相關(guān)，在池美珠的研究中孕母體內(nèi)合適的維生素D水平不僅可保護(hù)胎兒的骨骼發(fā)育，還可降低子代精神分裂或雙相情感障礙的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

那么，VDR基因多態(tài)性是通過哪種途徑影響VDR的功能？有研究表明，VDR基因SNP可能通過影響維生素D受體的mRNA表達(dá)，從而導(dǎo)致受體蛋白活性或者數(shù)量上不同，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)基因反式放大作用[22]。另有一種假說提出可能在維生素D基因上有其他未知的多態(tài)性位點(diǎn)或在VDR基因所在的第12號(hào)染色體上存在其他相關(guān)聯(lián)的基因位點(diǎn)與佝僂病遺傳易感性相關(guān)，通過與VDR等位基因相連鎖進(jìn)而影響疾病過程[23]。也有學(xué)者認(rèn)為ATG突變?yōu)锳CG，F(xiàn)位點(diǎn)的VDR蛋白質(zhì)較f位點(diǎn)短3個(gè)氨基酸長度，故與配體親和力、mRNA的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)的活力較f位點(diǎn)高，從而增加腸道對(duì)鈣的吸收，促進(jìn)鈣磷在骨骼中的沉積[24-25]。本研究中孕婦VDR基因型為TT型者，血清中25-羥維生素D水平最低，對(duì)應(yīng)的臍血25-羥維生素D水平亦最低，TC型次之，提示VDR基因Fok I位點(diǎn)TT型吸收維生素D能力差，進(jìn)而導(dǎo)致新生兒缺乏25-羥維生素D，有可能造成新生兒先天性佝僂病。筆者建議對(duì)孕婦進(jìn)行VDR基因Fok I位點(diǎn)多態(tài)性及血清25-羥維生素D水平的檢測，及時(shí)個(gè)體化補(bǔ)充維生素D，以預(yù)防嬰幼兒先天性佝僂病的發(fā)生。