亞鐵螯合酶對人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞的影響及作用機制研究

孫維棟 余醒醒 安依涵 王鑫 王瑩 童向民

活性氧（reactive oxygen species,ROS）是一類由氧形成，并在分子組成上含有氧，化學性質比氧自身活潑的氧原子或原子團[1]，在機體內不斷產生及清除的過程中依然保持氧化-還原系統的穩定，并在人體整個生理過程中發揮重要作用。當機體處于疾病狀態或受到外源性物質刺激后，這種動態平衡可能被打破，如ROS的產生增多或抗氧化酶的減少（即ROS過剩），觸發細胞多個促凋亡通路[2]，對細胞造成傷害，嚴重時導致細胞凋亡。癌細胞因為相對正常細胞存在致癌刺激、代謝功能增加和線粒體功能障礙[3]，能產生較高水平的ROS。但在持續的氧化應激下，癌細胞通過一系列機制能很好地適應這種壓力，不僅可以激活ROS清除系統，還可以抑制細胞凋亡[4]。研究發現，細胞內過多的鐵可誘導產生大量的ROS，給細胞帶來致命性損傷[5]。鐵進入細胞后，被轉運入線粒體，或儲存在鐵蛋白中[6]。鐵在線粒體中被用于合成鐵硫簇和血紅素。而合成血紅素的最后一步是二價鐵離子嵌入原卟啉Ⅸ，需要亞鐵螯合酶（ferrochelatase,FECH）催化。FECH能夠與ATP結合盒膜轉運蛋白 10（ATP-binding-cassette B 10,ABCB10）以及線粒體轉鐵蛋白-1（mitoferrin-1,MFRN1）構成一個位于線粒體內膜的鐵轉運復合體，參與把鐵從細胞質轉入線粒體的過程[7]。基于此，本研究運用短發夾（shRNA）在體外敲減人多發性骨髓瘤RPMI8226細胞中FECH的mRNA表達，阻斷原卟啉Ⅸ轉化為血紅素，改變細胞內鐵的水平，探討FECH對RPMI8226細胞ROS產生及對細胞增殖能力的影響和作用機制，現報道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 RPMI l640培養基、FBS購自美國Gibco公司，L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素購自上海遠慕生物科技有限公司，嘌呤霉素購自北京凱瑞基生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物科技研究所，二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購自天津濱韻科技公司，無RIPA裂解液購自上海碧云天生物科技研究所，SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自美國 Millipore公司，一抗 FECH（1∶1 000）、鐵調節蛋白 2（iron regulatory protein2,IRP2）（1∶1 000）、轉鐵蛋白受體 1（transferrin receptor1,TfR1）（1∶1 000）、過氧化氫酶（Catalases）（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000）均購自美國賽信通公司，兔抗鼠二抗（1∶5 000）購自上海碧云天生物科技研究所，顯影劑購自七海生物科技公司，血清RPMI-1640培養液購自美國Hyclone公司，酶標儀購自美國伯騰儀器有限公司，流式細胞儀購自美國艾森生物有限公司，雙色紅外激光掃描成像系統購自美國LI-COR公司，Gel-Pro-Analyzer軟件為美國貝塞斯達軟件公司產品。

1.2 細胞培養 RPMI8226細胞購自美國模式培養物集存庫，293T細胞株購自中國科學院細胞庫，常規培養于含 10% FBS、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/ml青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養液中，置于37℃、含5% CO2和95%空氣的潮濕培養箱中培養。

1.3 FECH shRNA的設計、合成和轉染 根據FECH基因序列設計靶向FECH序列的FECH shRNA 5'-CCCAAGGGTAATAAACGTGTA-3'，將 FECH shRNA 和空載對照ctrl shRNA質粒轉染至293T細胞，轉染48h后慢病毒液用0.22μm過濾器過濾并用于轉染。RPMI8226細胞在24孔板轉染后在37℃溫育24 h后用嘌呤霉素（10 mg/ml）逐步篩選，后采用Western blot驗證。

1.4 細胞增殖試驗 采用CCK-8法。分別將FECH shRNA和空載對照ctrl shRNA轉染后的RPMI8226細胞接種在96孔板中（4×103細胞/孔），用含有10% FBS的RPMI 1640培養養液在37℃、5% CO2的培養箱培育，分別在 24、36、48、60、72、84、96 h 后加 CCK-8 10 μl，2 h后在酶標儀450 nm處測定吸光度，測定結果用生長曲線描述細胞增殖情況。

1.5 細胞ROS測定 分別將FECH shRNA和空載對照ctrl shRN轉染后的RPMI8226細胞以每孔200×104細胞接種到6孔板，培育8 h后，收細胞PBS洗滌后在1.5 ml EP管內加入無血清RPMI 1640培養液500μl，再加入2μmol/L二氯熒光素二乙酸酯（DCFH-DA），在37℃黑暗環境中溫育20 min，吹打混勻后在流式細胞儀中測定ROS（激發波長485 nm，發射波長530 nm）。

1.6 細胞鐵代謝和抗氧化蛋白表達檢測 采用Western blot法。分別將FECH shRNA和空載對照ctrl shRNA轉染后的RPMI8226細胞經PBS洗滌后，提取細胞至1.5 ml EP管，加入加酶抑制劑的RIPA裂解液冰上靜置 10 min使細胞充分裂解，12 000 r/min離心10 min，取上清液提取總蛋白，并將濃度調至同一濃度。配SDS-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）上樣10 ul電泳，然后轉膜到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉1 h后，孵育一抗 FECH（1∶1 000）、IRP2（1∶1 000）、TfR1（1∶1 000）、Catalases（1∶2 000）、β-Actin（1∶6 000），在 4 ℃過夜，隨后與其相應的二抗（1∶5 000）孵育 1 h，用顯影劑和Gel-Pro-Analyzer軟件來顯影和測量相對強度。以β-Actin作為內參。

1.7 統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件。計量資料以表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FECH敲減RPMI8226細胞的構建驗證 分別將FECH shRNA和空載對照ctrl shRNA轉染RPMI8226細胞，Western blot驗證顯示FECH敲減RPMI8226細胞構建成功，見圖1。

圖1 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA和空載對照ctrl shRNA轉染RPMI8226細胞后FECH表達電泳圖

2.2 FECH shRNA RPMI8226細胞和ctrl shRNA RPMI8226 細胞增殖能力比較 培育 24、36、48、60、72、84、96 h時，FECH shRNA RPMI8226細胞吸光度均低于ctrl shRNA RPMI8226細胞（均 P＜0.05），即增殖能力較ctrl shRNA RPMI8226細胞減弱，生長曲線見圖2。

圖2 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226細胞和ctrl shRNA RPMI8226細胞生長曲線比較

2.3 FECH shRNA RPMI8226細胞和ctrl shRNA RPMI8226細胞ROS產生情況比較 流式細胞術檢測顯示，相對ctrl shRNA RPMI8226細胞，FECH shRNA RPMI8226細胞 ROS產生增加（1.52±0.8）倍。

2.4 FECH shRNA RPMI8226細胞和 ctrl shRNA RPMI8226細胞 IRP2、TfR1、Catalases表達情況比較 與ctrl shRNA RPMI8226 細胞相比，FECH shRNA RPMI8226細胞IRP2、TfR1表達上調，Catalases表達下調，見圖3。

圖3 亞鐵螯合酶（FECH）shRNA RPMI8226細胞和ctrl shRNA RPMI8226 細胞鐵調節蛋白 2（IRP2）、轉鐵蛋白受體 1（TfR1）、過氧化氫酶（Catalases）表達情況比較（a為蛋白表達電泳圖；b、c、d分別為IRP2、TfR1、Catalase相對表達水平比較）

3 討論

多發性骨髓瘤是發生于B細胞終末分化階段的惡性疾病，是惡性漿細胞在骨髓內異常增生，伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈（M蛋白）過度生成，常合并多發性溶骨性損害、高鈣血癥、貧血、腎臟損害，引起骨折、骨髓功能衰竭及腎臟疾病，產生一系列臨床癥狀[8]。不進行治療的進展期多發性骨髓瘤患者中位生存期僅有6個月，而接受傳統化療的中位生存期也不超過3年，僅有25%患者的生存期在5年以上[9]。近幾年來，新的治療藥物，如來那度胺和硼替佐米已用于多發性骨髓瘤的治療，盡管目前治療有了更好的臨床效果，但還有不少患者最終死于復發和難治性疾病，因此需要新的治療靶點和藥物來延長復發時間或更有效地達到治療目標。ROS在機體的免疫過程和細胞信號轉導中起重要作用，當細胞內活性氧過多積聚，超過抗氧化酶系統的清除能力，就會產生氧化應激，引發脂質過氧化反應損傷細胞膜、引起蛋白質變性、酶活性喪失等損害作用[10]。

本研究運用shRNA技術抑制RPMI8226細胞的FECH表達。通過敲減RPMI8226細胞的FECH，研究其引起細胞內ROS水平變化的機制及其對癌細胞增殖的影響，從而為多發性骨髓瘤臨床治療提供新的突破口和治療靶點。細胞質中鐵調節蛋白（iron regulatory proteins,IRPs）監測細胞內鐵水平，調節細胞內鐵攝取、轉運和儲存蛋白的合成和表達[11]。RPMI8226細胞的FECH敲減后，線粒體內血紅素合成障礙，線粒體向細胞質傳遞了持續輸入鐵的信號以恢復血紅素的正常合成，引起IRP2表達上調。IRP2表達上調后，IRP2與調節鐵反應元件（iron responsive elements,IREs）結合，在轉錄或轉錄后水平上促進了TfR1的表達與合成[12]。細胞內TfR1的表達上調，與血液中的轉運亞鐵離子的轉鐵蛋白（transferrin,Tf）結合，促進了亞鐵離子轉入細胞內[13]。而細胞內亞鐵離子累積，通過Fenton和Haber-Weiss-like反應產生ROS[14]。細胞內ROS產生增多，造成細胞毒性[11]。同時細細胞內Catalases蛋白水平下降，清除H2O2能力下降[15]，使ROS降解減少，細胞內ROS過剩，細胞抗氧化能力下降，增加了細胞內的氧化應激，造成細胞功能損傷。因此，FECH敲減后的RPMI8226細胞因鐵積累后ROS產生增多，同時抗氧化酶減少降低了ROS的降解，打破了細胞內氧化-還原系統的平衡，使細胞內ROS明顯增多，產生氧化應激，增加了對細胞的毒性[16]，最終導致細胞增殖能力下降。

綜上所述，FECH對維持RPMI8226細胞氧化還原的動態平衡起重要作用。FECH表達受抑制后，RPMI8226細胞IRP2、TfR1表達上調，細胞內鐵過載，ROS產生增多，同時抗氧化蛋白Catalases表達下調，細胞抗氧化能力下降，引發細胞氧化應激，抑制細胞增殖。