調(diào)脾護心方對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用*

張敏敏，袁良，王銀燕，劉玲，劉攀，戴小華

1 安徽中醫(yī)藥大學 安徽合肥 230038

2 安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 安徽合肥 230031

3 安徽省中西醫(yī)結合醫(yī)院 安徽合肥 230031

心肌缺血/再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指急性心肌缺血復灌后，非但不能減輕心肌組織損傷，反而加重甚至導致不可逆性損傷的現(xiàn)象。近年來，心肌缺血性疾病發(fā)生率總體呈不斷上升趨勢，介入治療如經(jīng)皮冠狀動脈介入術（PCI）等技術在臨床廣泛開展，雖然可迅速恢復心肌血供，挽救更多瀕死心肌，更大可能保護心臟功能，但亦可同時引發(fā)MIRI。越來越多的臨床研究表明，在規(guī)范治療的基礎上，采用有效治療手段減輕MIRI，能進一步保護心功能，改善心梗患者遠期預后，已成為國內(nèi)外學者研究熱點[1-2]。

細胞凋亡、氧化應激、鈣超載以及能量代謝障礙等多種機制參與MIRI的發(fā)生發(fā)展[3]，因此尋找多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點治療藥物具有重要意義。調(diào)脾護心方由安徽省中醫(yī)院心內(nèi)科戴小華主任提出，由經(jīng)方歸脾湯和酸棗仁湯加減化裁，前期臨床研究表明在治療穩(wěn)定型心絞痛、缺血性心肌病、缺血再灌注損傷等方面調(diào)脾護心方發(fā)揮顯著療效[4-5]；動物研究也發(fā)現(xiàn)[6-8]，調(diào)脾護心方可改善心肌梗死后心肌缺血，保護受損心肌。目前調(diào)脾護心方對MIRI的動物實驗研究未見報道。本研究通過建立MIRI大鼠模型，探討調(diào)脾護心方對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

材料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 12周齡SD雄性正常大鼠，體重200g左右（200±20g），所有大鼠均由安醫(yī)大動物實驗中心[許可證SCXK（皖）2019-001]提供。確保大鼠分開飼養(yǎng)、食水充足、晝夜節(jié)律正常。操作過程中嚴格按照科技部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》以及《赫爾辛基宣言》基本原則處理動物。

1.2 實驗藥物 由安徽省中醫(yī)院制劑中心提供中藥“調(diào)脾護心方”（陳皮6g、白術10g、茯苓10g、酸棗仁10g、灸遠志 6g、灸甘草 3g、廣木香 6g、蒲公英 10g）；烏拉坦：臨時使用生理鹽水配制成濃度為20%的烏拉坦溶液。

1.3 試劑與儀器 天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、血清乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒均購于Nanjing Jiancheng Biotechnology Co.LTD；心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）試劑盒購于Beijing Andy Huatai Biotechnology Co.LTD；BX51光學顯微均購自Olympus Optical。

2 方法

2.1 模型制備 參照文獻[9]方法進行冠脈結扎。使用20%烏拉坦（1g/kg）溶液麻醉大鼠后，取仰臥位固定四肢；連接四通道生理記錄儀（BL－420S生物機能實驗系統(tǒng)），記錄標Ⅱ導聯(lián)心電圖，發(fā)現(xiàn)異常者予以剔除；切開大鼠氣管并插入氣管套管作正壓呼吸。備皮、消毒、開胸，擠出心臟，在室間溝處左心耳下方穿線，結扎LAD后將心臟回納入胸腔，缺血30min后再灌注，結扎后立即關閉胸腔快速擠出胸腔內(nèi)的氣體，通過恢復負壓，以助大鼠恢復自主呼吸?？p合，記錄心電圖，術后腹腔注射少量青霉素防止感染。結扎成功標志：結扎線遠端心肌顏色紫紺，心電圖顯示為ST段抬高。模型制備成功標志：松開結扎線恢復冠脈血流，缺血心肌顏色恢復，抬高的ST段回落，表明模型制備成功。

2.2 分組及給藥 40只大鼠隨機分為4組：即模型組、假手術組、調(diào)脾護心方高、低劑量組。假手術組LAD只穿線不結扎，其他各組分別以術后成模大鼠進行后續(xù)試驗，各組物如下：模型組（等量0.9%生理鹽水，10mL/kg）、假手術組（等量0.9%生理鹽水，10mL/kg）、調(diào)脾護心方低劑量組（調(diào)脾護心方5.85g生藥/kg）、調(diào)脾護心方高劑量組（調(diào)脾護心方23.4g生藥/kg），連續(xù)14天，一日2次，于第2周末禁食水，處理大鼠，分別收取標本檢測。

調(diào)脾護心方高劑量組大鼠未發(fā)生死亡，假手術組、模型組、調(diào)脾護心方低劑量組因建模手術分別死亡1、2、1只（氣管拔管失敗死亡1只，結扎后即刻出現(xiàn)室顫死亡2只，術后感染死亡1只），實驗結束存活大鼠為36只。

3 檢測指標

3.1 心肌病理學改變 4%多聚甲醛固定大鼠心肌組織4h（4℃）后，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察其病理學改變。

3.2 血清 CK-MB、cTnI、AST、LDH、SOD、MDA 檢測 第2周末，抽取大鼠腹主動脈血，3000r/min離心15min，取上清于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，各項指標的測定嚴格按試劑盒說明進行。

4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 26.0軟件包_進行統(tǒng)計學處理。連續(xù)型變量以“均數(shù)±標準差（）”表示，多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 MIRI大鼠造模成功心電圖變化

見圖1、圖2、圖3。圖1、圖2、圖3分別展示了大鼠正常心電圖、結扎LAD后心電圖、解扎LAD恢復冠脈血流后心電圖。圖2見弓背向上抬高的ST段，圖3可見抬高的ST段回落，表明MIRI模型制備成功。

圖1 造模前心電圖

圖2 結扎LAD后心電圖

圖3 解扎LAD恢復冠脈血流后心電圖

2 各組大鼠心肌HE染色結果比較

見圖4。HE染色結果可見，假手術組心肌纖維排列整齊，細胞核清晰可見，心肌組織無明顯的病理改變。模型組心肌纖維排列紊亂、扭曲，細胞核腫脹、聚集、破裂 ，心肌組織周圍可見大量炎性細胞浸潤。與模型組比較，調(diào)脾護心方組心肌纖維排列基本整齊，細胞核呈淡染，結構模糊，心肌組織伴少量炎性細胞浸潤，高劑量組較低劑量組明顯。表明調(diào)脾護心組可改善心肌缺血后損傷，維持細胞正常形態(tài)。

3 各組大鼠的血清心肌酶結果比較

結果表明，與假手術組比較，各組血清LDH、cTnI、AST、CK-MB均明顯升高，各組數(shù)值具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組比較，調(diào)脾護心方高低劑量組均可降低血清LDH、cTnI、AST、CK-MB水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；調(diào)脾護心方高低劑量組組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明調(diào)脾護心方能降低大鼠血清心肌酶水平，且存在藥物劑量關系。見表2。

表2 各組大鼠的血清CK-MB、cTnI、AST、LDH水平比較（）

表2 各組大鼠的血清CK-MB、cTnI、AST、LDH水平比較（）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05；與調(diào)脾護心方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 例數(shù) CK-MB/ng·mL-1 cTnI/ng·L-1 AST/U·L-1 LDH/U·L-1假手術組 9 5.83±0.50 87.86±8.51 11.36±1.22 4362.94±115.78模型組 8 27.24±2.24** 291.34±39.15** 13.55±1.15** 6254.71±114.21**低劑量組 9 12.94±1.23**△ 200.02±24.64**△ 15.63±0.52*△ 5789.41±77.49*△高劑量組 10 12.42±1.03*△▲ 170.34±12.18*△▲ 15.47±0.48*△▲ 5178.82±53.29*△▲

4 各組大鼠的血清氧化應激酶結果比較

結果表明，與假手術組相比較，各組大鼠心肌組織中的MDA含量明顯增加，SOD含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01）。與模型組相比較，調(diào)脾護心方高、低劑量組能顯著增加心肌組織中的SOD含量，降低心肌組織中的MDA含量，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或0.01），表明調(diào)脾護心方能降低心肌過氧化損傷，提高心肌組織抗氧化能力。調(diào)脾護心方高、低劑量組組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明調(diào)脾護心方可提高心肌抗氧化能力，且存在藥物劑量關系。見表3。

表3 各組大鼠的血清SOD、MDA水平比較（）

表3 各組大鼠的血清SOD、MDA水平比較（）

與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與調(diào)脾護心方低劑量組比較，▲P＜0.05。

組別 例數(shù) SOD/U·mL-1 MDA/nmol·mL-1假手術組 9 115.90±3.71 3.64±0.38模型組 8 87.52±3.70** 8.07±0.76**低劑量組 9 105.00±3.10**△ 5.26±0.29*△高劑量組 10 107.86±3.49*△▲ 5.22±0.34*△△▲

討 論

圖4 各組大鼠心肌HE染色結果比較

MIRI的特點主要為梗死心肌恢復血流再灌注時，此時梗死區(qū)域心肌組織缺血缺氧狀態(tài)非但沒有改善反而加重并伴有血清心肌酶活性升高，同時心肌組織中出現(xiàn)大量氧自由基，促發(fā)氧化應激反應，破壞心肌細胞膜，損害心肌組織，導致大量心肌細胞死亡，嚴重影響心功能及預后[10]。本研究結果顯示模型組大鼠SOD活性降低，LDH、cTnI、AST、CK-MB、MDA水平升高，且心肌組織出現(xiàn)明顯病理性損傷，提示MIRI大鼠模型制備成功。

MIRI在中醫(yī)學歸屬于“胸痹”、“真心痛”、“心悸”的范疇，基本病機是本虛標實，虛者為氣血陰陽虧損，心失所養(yǎng)，實者多由痰濁擾心、心脈瘀阻。治療上常以急則治其標為原則，以活血化瘀、化痰通絡佐以健脾養(yǎng)心之法[11]。孫思邈《備急千金要方》：“心勞病者，健脾以益之，脾旺則感于心矣”，提出健脾養(yǎng)心之法，后世醫(yī)家在其基礎上充實發(fā)揮，從脾論治胸痹病，收效頗豐[12]。調(diào)脾護心方由經(jīng)方歸脾湯和酸棗仁湯加減化裁而來，主要有陳皮、白術、茯苓、酸棗仁、灸遠志、灸甘草、廣木香、蒲公英等，方中酸棗仁補血養(yǎng)肝，白術健脾益氣，茯苓、遠志安神寧心，木香、陳皮、蒲公英理氣和胃、燥濕醒脾，甘草為補氣旺脾，調(diào)和諸藥。諸藥合用，全方行益氣健脾，養(yǎng)心安神之功。現(xiàn)代藥理學認為：白術、蒲公英、木香可抗血小板聚集，阻止血栓形成[13，14，15]。酸棗仁、遠志能夠改善心肌缺血，縮小心梗面積[16，17]。茯苓能提高氧化應激酶活性，減少自由基對心肌細胞的損傷，改善心功能[18]。陳皮能夠改善冠脈血流，糾正心肌缺血缺氧狀態(tài)，同時可減輕動脈粥樣硬化，并具有抗血栓及抗氧化的作用[19]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)脾護心方處理后MIRI大鼠SOD活性升高，LDH、cTnI、AST、CK-MB、MDA水平降低，心肌組織病理損傷小于模型組，且高劑量調(diào)脾護心方較低劑量組作用更明顯，表明調(diào)脾護心方可減輕缺血再灌注心肌損傷，提高心肌組織抗氧化、清除氧自由基能力，減少心肌組織病理損傷，對心肌缺血再灌注損傷有良好的保護作用。但調(diào)脾護心方對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用具體機制尚不清楚，需進一步研究探索，以期為臨床實踐提供參考證據(jù)。