黑枸杞花青素通過Ⅲ-PI3K通路調控小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬

武 強，薛才華，王夢杰，劉嘉華，張龍飛，吳 華

(青海大學 農牧學院，青海 西寧 810016)

黑枸杞又被稱為“甘枸杞”，茄科枸杞屬中的植物，屬于類黃酮化合物，是一種滋補藥材，被稱為“滋補軟黃金”。是我國西北部鹽化沙地、沼澤、荒漠地區所特有的生命力頑強的藥用植物。黑枸杞中主要含有氨基酸、多酚、不飽和脂肪酸、多糖、花青素、維生素E以及各種微量元素，有著極高的營養價值和藥用價值[1-2]。花青素是一種黃酮類的水溶性色素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抑菌、等多種藥理作用[3]。細胞自噬(Autophagy)是真核生物進行自我保護的一種機制，主要是通過溶酶體對細胞內的蛋白質和細胞器進行融合降解從而達到細胞穩態[4]。真核生物的大部分細胞在正常生理狀態下自噬會保持較低的水平，稱之為基礎自噬；當營養物質或能量缺乏、受到病毒，微生物等病原體刺激時，細胞的自噬水平會發生較大的提升，稱為誘導性自噬[5]。目前，越來越多的研究表明，細胞自噬與機體的免疫系統存在很大的聯系，其與病原的清除、炎癥反應以及抗原呈遞存在緊密聯系[6-7]。

黑枸杞花青素具有多種生理功能，但基于細胞自噬揭示免疫功能的研究較少。巨噬細胞是機體免疫系統功能中重要的組成部分，其主要功能是參與抗原處理、消滅各種病原微生物、抗腫瘤作用等。巨噬細胞與自噬有著密不可分的聯系，巨噬細胞可通過其對入侵細胞的內吞作用形成自噬體結構，再與溶酶體融合形成成熟的吞噬溶酶體，以有效殺傷清除細菌[8]。基于此，本文擬探究黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞Raw264.7自噬的調節作用，為深入研究黑枸杞花青素對細胞水平的免疫功能機制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠巨噬細胞株RAW264.7，購買于中國科學院上海細胞庫；黑枸杞花青素購于青海金麥杞生物科技有限公司(純度61%、灰分0.6%、蛋白質6%、糖1.32%、氨基酸3.56%)；CCK-8試劑盒購自上海尚寶生物科技有限公司；DMEM干粉、胎牛血清均購自于Gibco公司；PBS購自Hfart公司；刀豆球蛋白(ConA) 購自XINTAI公司；3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)購自MedChemExpress公司；胰蛋白酶EDTA溶液0.25%均購自Solarbio公司；山羊抗IgG購自Abcam公司；LC3-Ⅱ抗體購自BOSTER公司；Beclin-1抗體購自Biodragon公司；Ⅲ-PI3K抗體購自SAB公司；Ant-GAPDH購自Immunoway公司；BCA蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺，購自江蘇通凈凈化設備有限公司；CO2細胞培養箱，購自美國NUAIRE公司；高速低溫離心機，購自英國Dynamica公司；酶標儀，購自意大利MuLTISKAN公司；Western blot 轉膜儀，Western blot 電泳儀，Western blot 電源均購自北京六一生物科技公司；搖床購自美國SCILOGEX公司；化學發光成像儀購自北京賽智科技有限公司。

1.3 試劑配制

黑枸杞花青素溶液的配制：將黑枸杞花青素溶解于DMEM培養基中，配置濃度為100 μg/mL 的黑枸杞花青素溶液為母液稀釋使用，4 ℃冰箱避光保存；刀豆球蛋白(ConA)溶液的配制：取出2.5 mg的ConA粉末，溶解在1 mL的DMEM培養基中作母液稀釋使用，試驗中ConA最終濃度為2.5 μg/mL，-20 ℃保存備用；3-MA抑制劑配制：稱取0.015 g 3-MA 溶于1 mL培養基，37 ℃培養箱放置2 h，溶解配制成濃度為100 mM/L的母液稀釋使用，置于4 ℃冰箱保存使用，試驗中3-MA最終濃度為5 mM。

1.4 細胞培養

將小鼠巨噬細胞Raw264.7 置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養箱中培養，用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養液進行培養，每24 h換一次液，待細胞生長約70%～80%融合時將其傳代，2～3 d進行一次細胞傳代，傳代培養足夠的細胞以備用。

1.5 CCK8檢測細胞活力

待細胞傳代至足量后，調整細胞濃度為1×106，取體積為100 μL的細胞接種至96孔板，常規培養，每組三個重復，待細胞達到70%～80% 融合時，對細胞進行處理。黑枸杞花青素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7的濃度分別為0、12.5、25、50、100 μg/mL，以0 μg/mL為對照組，并設不加細胞的空白組，分別在細胞培養箱中培養12 h、24 h、36 h、48 h之后加入10 μL的CCK-8試劑繼續孵育2 h之后用酶標儀測定波長在490 nm處的OD值；刀豆球蛋白(ConA)結合花青素的試驗與上述一致，但ConA最終濃度為2.5 μg/mL。細胞活力%=[(試驗組-空白組)/(對照組-空白組)]×100%。

1.6 Western Blot 檢測自噬因子蛋白的表達

分別收集各組細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，利用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白含量。用30 μL 5×上樣緩沖液與120 μL蛋白樣本混合于200 μL的離心管中，于PCR儀上變性，經SDS-PAGE 電泳后，半干轉轉膜至PVDF膜，按比例配制 LC3-Ⅱ抗體、Beclin-1抗體、Ⅲ-PI3K抗體、及 GADPH 抗體，4 ℃封閉過夜，TBST洗膜，室溫5×6 min搖洗，加入山羊抗IgG二抗，室溫1 h后TBST洗膜，室溫5×6 min搖洗。將保鮮膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，將PVDF膜正面(蛋白附著面)朝上，放置于薄膜里。將發光液試劑盒中兩種液體按1∶1比例混合、搖勻。滴加到PVDF膜上，反應5 min。用鑷子夾起PVDF膜一角，使發光液自然流下，曝光顯影觀察。

1.7 數據處理

采用Image J對條帶量化，所有試驗數據經Excel軟件初步處理后，采用SPSS Statistics 21統計軟件進行方差分析，LSD法進行多重比較，表中數據以“平均數±標準差”表示，利用Origin Pro 9.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

由圖1可以看出，用不同濃度黑枸杞花青素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7，與對照組相比，25 μg/mL的黑枸杞花青素誘導12 h、24 h、36 h、48 h細胞活力均顯著增加(P<0.05)，且24 h細胞活力最高；其他組與對照組相比，作用24 h細胞活力有所提高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖1 不同濃度黑枸杞花青素在不同時間對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響*.差異顯著(P<0.05)，**.差異極顯著(P<0.01)。下同。Fig.1 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts of different concentrations on cell viability of mouse macrophage RAW264.7 at* means significant difference (P<0.05)，** highly significant difference (P<0.01).The same below.

2.2 黑枸杞花青素結合ConA對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響

由圖2結果可知，不同濃度黑枸杞花青素結合ConA能提高小鼠巨噬細胞RAW264.7的細胞活力，并與劑量、時間有一定關系。與對照組相比，花青素(25 μg/mL)+ConA、50 μg/mL+ConA、100 μg/mL+ConA作用時間12 h、24 h、36 h、48 h的細胞活力均顯著增加(P<0.05)；與對照組相比，12.5 μg/mL+ConA作用時間24 h細胞活力顯著增加(P<0.05)，作用時間12 h、36 h、48 h沒有顯著變化(P>0.05)。

圖2 不同濃度黑枸杞花青素結合ConA對小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響Fig.2 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts of different concentrations combined with ConA on cell viability of mouse macrophage RAW264.7 at different time

2.3 黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組相比，花青素各濃度組中LC3-Ⅱ的蛋白表達顯著性降低(P<0.01)，呈濃度依賴性，花青素濃度越高LC3-Ⅱ的蛋白表達降低越多；與對照組相比，花青素各濃度組中的Beclin-1的蛋白表達也顯著性降低(P<0.01)，呈濃度依賴性，花青素濃度越高Beclin-1的蛋白表達降低越多。

圖3 不同濃度黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7噬因子LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達的影響Fig.3 Effects of different concentrations of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts on the expression of autophagy factor LC3-Ⅱand Beclin-1 protein in mouse macrophage RAW264.7

2.4 黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬Ⅲ-PI3K調控通路的影響

如圖4所示，與對照組相比，Beclin-1和Ⅲ-PI3K的花青素組，3-甲基腺嘌呤組和花青素+3-甲基腺嘌呤組都顯著降低(P<0.01)。與3-甲基腺自嘌呤組相比，Beclin-1的花青素組高于3-甲基腺嘌呤組，但差異不顯著(P>0.05)，花青素+3-甲基腺嘌呤組顯著降低(P<0.01)；與3-甲基腺嘌呤組相比，Ⅲ-PI3K的花青素組顯著高于3-甲基腺嘌呤組(P<0.01)。花青素+3-甲基腺嘌呤組顯著降低(P<0.05)。

圖4 黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬Ⅲ-PI3K調控通路相關因子蛋白的影響與3-MA組相比#表示差異顯著(P<0.05) ,##表示差異極顯著(P<0.01)Fig.4 Effects of lycium ruthenicum murray anthocyanin extracts on proteins related to autophagy Ⅲ-PI3K regulation pathway of mouse macrophage RAW264.7Compared with 3-MA group,# means significant difference (P<0.05),## highly extremely significant difference (P<0.01)

3 討 論

巨噬細胞(Macrophages)是機體先天固有免疫的重要組成部分之一，巨噬細胞不僅能夠清除體內壞死的細胞，還能清除入侵機體的病原體。花青素屬于酚類中的類黃酮物質，是一類植物中廣泛存在的水溶性天然色素，具有抵抗炎癥、抗氧化、抗腫瘤細胞增殖的功效[9]。研究表明，不同濃度的葡萄籽花青素具有促前脂肪細胞增殖的作用，能有效抑制脂肪沉積[10]。王禹等[11]通過用不同劑量的紫甘薯花青素飼喂小鼠，發現紫甘薯花青素能夠顯著保護肝組織的損傷，提高肝細胞的增殖能力。細胞活力的大小也能反映細胞的增殖能力，本試驗結果顯示，25 μg/mL的黑枸杞花青素能顯著提高小鼠巨噬細胞RAW264.7的活力促進其增殖；50 μg/mL和100 μg/mL濃度的黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7活力影響差異不顯著，表明隨著花青素濃度的升高，對小鼠巨噬細胞RAW264.7增殖能力下降。為驗證結果的科學性，利用不同濃度的黑枸杞花青素結合刀豆球蛋白(ConA)檢測其對小鼠巨噬細胞RAW264.7活力的影響，ConA能促進細胞分裂(促有絲分裂作用)，增加細胞活力。結果表明濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL均能顯著提高細胞活力且時間為24 h最佳。

研究表明，細胞自噬普遍存在于真核生物細胞中，它與細胞的增殖、凋亡、衰老息息相關。但自噬導致的細胞死亡和細胞凋亡不同，因此被稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[12]。在自噬的發生過程中，有很多的自噬相關蛋白參與。自噬相關蛋白是由自噬的相關基因編碼產生，目前發現的自噬相關基因有40多個。其中Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異性基因[13]，是酵母中 Atg6/VPs30 的同源基因，主要是通過與Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶( ClassⅢPI3K) 形成復合體來調節其他自噬相關基因編碼蛋白，并在自噬前體結構中定位，從而調節自噬活性[14]。LC3-Ⅱ自噬因子在自噬體的形成過程中起關鍵性作用，LC3-Ⅱ能夠與新形成的膜結合，參與自噬溶酶體(Autolysosome) 的形成因此LC3-Ⅱ自噬因子被用作自噬形成的標志[15]。本試驗用不同濃度的黑枸杞花青素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7檢測自噬因子Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達，結果發現黑枸杞花青素抑制了Beclin-1和LC3-Ⅱ的蛋白表達，且對濃度有依賴性。表明黑枸杞花青素對小鼠巨噬細胞RAW264.7的自噬有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強。

研究表明，Ⅲ-PI3K自噬調控通路中起核心作用的是Ⅲ-PI3K-Beclin-1復合體，該復合體由Beclin-1、Bcl-2、UVRAG和Ⅲ-PI3K組成，其在自噬形成的早期階段對自噬體的成熟和運輸起到關鍵作用[16]。3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)是一種常用的自噬抑制劑，其機制是通過抑制Ⅲ-PI3K而阻礙自噬體形成。本試驗結果表明，黑枸杞花青素能抑制Ⅲ-PI3K通路上因子的蛋白表達，且在3-MA的作用下，黑枸杞花青素顯著降低了Ⅲ-PI3K和Beclin-1的蛋白表達，表明黑枸杞花青素抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬可能與Ⅲ-PI3K自噬調控通路有關。

4 結 論

本研究結果表明，黑枸杞花青素誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7的最佳濃度為25 μg/mL，最佳作用時間為24 h；同時黑枸杞花青素能抑制小鼠巨噬細胞RAW264.7自噬，其調控機理可能與Ⅲ-PI3K自噬調控通路有關。