chi-miR-128-3p和chi-miR-218對Nr1d2基因的靶向調控研究

王世杰，張薇依，王建芳，毛 潮，隋 潔，賈存靈

(西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

在哺乳動物中，有節律的生理和行為功能的組織受控于位于下丘腦視交叉上核(SCN)。控制節律的組織不限于SCN，而在大多數外周組織中也有分子鐘表達和作用[1]。哺乳動物體內大約5%到10%的轉錄本呈現節律性[2]，蛋白質組分析顯示，大約有20%的蛋白呈周期性表達，其中一些具有相應的mRNA表達[3]。此外，呈周期性表達的mRNA比前體RNA更豐富[4]，這些差異表示轉錄后和翻譯后修飾機制在調節生物節律中的重要性。

microRNA(miRNA)是一類小的單鏈RNA分子，長度約為18～25nt，由基因組非編碼區域轉錄[5]。通過與靶基因mRNA的3'端非翻譯區(3'untranslational region，3'UTR)內的互補位點結合來使mRNA翻譯抑制或轉錄降解來調節基因的表達，進行轉錄水平或轉錄后水平調控靶基因mRNA的表達[6]。從胚胎發育開始，到細胞凋亡，乃至腫瘤生長，miRNA在一系列生理和病理過程中發揮著重要的作用。研究表明，miRNA與生物節律存在聯系，miRNA可參與到中樞和外周生物節律的調控中[7]，如腦特異性的miR-132參與生物節律的光調控，可抑制光誘導的時相延遲，以達到節律同步作用[8]。在大鼠的研究中，鐘基因Bmal1與miR-103的表達相關，在轉錄后水平對晝夜節律進行調節[9]。在小鼠上利用基因芯片技術，研究以12L：12D的光照下肝臟上miRNA和mRNA之間的表達關系，發現205個miRNA靶向Clock、Bmal1、per1-3等鐘基因，說明miRNA在生物節律調控中發揮重要作用[10]。

在生物鐘基因中，Rev-erbβ(Nr1d2)基因是編碼核激素受體家族的一員，其編碼的蛋白能作為轉錄抑制因子參與晝夜節律變化，及碳水化合物和脂代謝過程[11]。Nr1d2基因在絨山羊毛囊的周期生長中存在表達差異[12]。據報道，安哥拉兔的miR-218能夠激活Wnt信號通路，在皮膚和毛囊發育過程中起動態調節作用[13]；miR-128通過靶向TGF-1的主要轉錄調控因子Smad2來調控人的毛囊間充質干細胞的分化[14]。因此，本研究通過對miR-218和miR-128與Nr1d2基因靶向關系進行初步的探究，以期為研究Nr1d2基因可能參與的毛囊發育等生物節律現象機制的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 miRNA的預測和篩選

根據miRNA與基因存在相互作用調控的關系，利用Target Scan網站對目標Nr1d2基因進行miRNA預測[15]。

1.2 雙熒光素酶報告載體的構建

用Premier 5軟件設計包含結合位點片段的引物，并插入限制性XhoI或NotI酶切位點(引物見表1)，以全基因組DNA為模板，擴增出包含靶點的目的片段，利用膠回收試劑盒Gel Extraction Kit(Omega)純化回收目的片段。將回收純化的目的片段和骨架載體psiCHECHETM-2，用限制性內切酶Xho1和Not1切割，連接回收純化后的切割產物，并轉化到DH5a感受態細胞中，用AMP培養基篩選陽性菌落，挑取單克隆，搖菌，將菌液送去測序；測序結果比對正確的菌液進行擴繁，用無內毒素質粒提取試劑盒Endo-Free Plasmid Midi Kit(Omega)提取質粒，以備后續細胞轉染試驗使用。

表1 PCR擴增引物Table 1 PCR primers

1.3 突變型雙熒光素酶報告載體的構建

根據點突變原理(圖1A)，用Premier 5軟件設計結合位點突變的引物(圖1B)，以上述連接成功的質粒為模板，擴增出包含突變靶點的質粒，PCR產物用DpnI酶處理，切除模板質粒。將產物轉化到DMT感受態(TransGen Biotech)，用AMP培養基篩選陽性菌落，挑取單克隆，搖菌，測序；測序結果正確的菌液提取質粒，以備后續細胞轉染實驗使用。

圖1 突變型載體的構建A.點突變原理(Trans Gen Biotech)；B.突變引物Fig.1 Construction of mutant vectorsA.Point mutation principle(TransGen Biotech)；B.Mutation primer

1.4 細胞分離培養和轉染

1.5 雙熒光素酶活性的檢測

為了驗證chi-miR-128-3p和chi-miR-218與Nr1d2基因的靶向關系，將上述構建好的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，通過mimics+WT，mimics NC+WT，mimics+MUT,mimics NC+MUT的方式進行共轉染在24孔板中，轉染后24～48 h檢測檢測細胞內相對RLU值(Relative lucifcrase activity)。

1.6 統計分析

使用SPSS 18.0(IBM)軟件進行t檢驗。每組結果數據均用平均值±標準差(Mean±SD)表示?！?”P<0.05為差異顯著，“**”P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 Nr1d2基因的miRNA的預測和篩選結果

Nr1d2基因的3'UTR區域與chi-miR-128-3p和chi-miR-218的結合位置如圖2A所示，其結合種子序列均為7 bp，chi-miR-128-3p與Nr1d2基因 3'UTR的結合位點為mRNA的2678-2685 bp處，chi-miR-218的結合位點為4114-4121 bp處。使用在線軟件BiBiServ[16]中的RNA hybrid功能對Nr1d2 mRNA 3'UTR與chi-miR-128-3p和chi-miR-218結合位點和結合自由能進行預測，并分析其二級結構(圖2B)。Nr1d2 mRNA的3'UTR與chi-miR-128-3p結合的自由能為-25 kcal/mol，Nr1d2 mRNA的3'UTR與chi-miR-218結合的自由能為-24 kcal/mol，相對而言，Nr1d2 mRNA 3'UTR與chi-miR-218可能更容易結合。

圖2 生物信息學分析A.Nr1d2 3'UTR結合區域；B.chi-miR-128-3p和chi-miR-218的二級結構Fig.2 Bioinformatics analysisA.Nr1d2 3'UTR binding region；B.Secondary structures of chi-miR-128-3p and chi-miR-218

2.2 構建出的野生型和突變型雙熒光素酶報告載體

PCR擴增得到Nr1d2 mRNA 3'UTR兩個片段克隆(圖3A)，對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，條帶大小如圖3C所示，與目標序列大小相符，之后利用XhoI和NotI內切酶對psiCHECKTM-2和目的片段雙酶切并連接，構建野生型雙熒光素酶報告載體psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-WT，并對chi-miR-128-3p和chi-miR-218結合位點進行突變，構建突變型雙熒光素酶報告載體psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-MUT，經公司測序顯示，結果與目標序列完全一致(圖3D)，表明成功構建了野生型和突變型雙熒光素酶報告載體。

圖3 雙熒光素酶報告載體的構建A.包含靶點的目的片段(Maker左側為包含chi-miR-128-3p靶點的3'UTR；Maker右側為包含chi-miR-218靶點的3'UTR)；B.psiCHECKTM-2載體；C.凝膠電泳圖；D.野生型和突變型載體部分測序結果Fig.3 Construction of a dual luciferase reporter vectorA.contains the target fragment of interest (The left side of the Maker was the 3'UTR containing chi-miR-128-3p target;the right side of the Maker was the 3'UTR containing chi-miR-218 target)；B.psiCHECKTM-2 vector；C.Gel electrophoresis；D.partial sequencing results of wild-type and mutant vectors

2.3 雙熒光素酶活性分析

構建成功的psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-WT、psiCHECKTM-2-Nr1d2-3'UTR-MUT與chi-miR-128-3p mimics、chi-miR-218 mimics、mimics NC分別共轉染到293 A細胞，轉染后24～48 h后檢測細胞內RLU值。結果表明，轉染chi-miR-128-3p mimics對野生型和突變型載體的熒光素酶活性無顯著影響(圖4A)。而轉染chi-miR-218 mimics能使野生型熒光素酶活性極顯著下降(P<0.01)，而對突變型熒光素酶活性無影響(圖4B)，試驗結果表明chi-miR-128-3p和Nr1d2的關系有待探究，但可以證明chi-miR-218通過靶向Nr1d2-3'UTR區域，抑制了雙熒光素酶的活性，初步確定Nr1d2是chi-miR-218的靶基因。

圖4 雙熒光素酶活性檢測A.chi-miR-128-3p雙熒光素酶活性檢測；B.chi-miR-218雙熒光素酶活性檢測；**表示P<0.01Fig.4 Dual luciferase assaysA.Dual luciferase assays of chi-miR-128-3p；B.Dual luciferase assays of chi-miR-218；** means P<0.01

3 討 論

生物節律驅使許多細胞功能呈現時間變化，包括基因表達、代謝以及細胞周期。生物鐘是由一組特定的轉錄因子組成的，這些轉錄因子構成了生物鐘的分子結構。許多環境因素如食物、光照和溫度等會影響生物節律及相關生物鐘基因的表達變化[17]，這些變化常常受表觀遺傳的調控。miRNA是其中一種表觀遺傳修飾，它廣泛存在于動物中，在生物體內的功能作用和調控機制已有大量研究報道[18]，其參與生物節律的調控日益受到研究者的重視。研究發現，Nr1d2在調節飲食行為和能量消耗方面的起到關鍵作用，Nr1d2基因敲除后，小鼠表現出飲食依賴性的代謝失調[19]；Nr1d2也參與毛囊的發育[12]。但有關該基因可能與哪些miRNA有關鮮有報道。因此本研究用雙熒光素酶檢測系統確定miRNA與預測靶基因調控關系。

通過用Target Scan網站進行初步篩選，最終確定了chi-miR-128-3p和chi-miR-218，并成功構建了野生型以及突變型雙熒光素酶報告載體。將chi-miR-128-3p和chi-miR-218的mimics以及mimics NC分別與構建的雙熒光素酶報告載體共轉染到293A細胞系中進行培養，結果顯示chi-miR-128-3p對細胞RLU值無顯著影響，說明chi-miR-128-3p與Nr1d2不存在靶向關系。chi-miR-218對細胞RLU值有顯著的影響(P<0.01)，因此，初步判定chi-miR-218與Nr1d2存在靶向關系。研究顯示，miR-218通過靶向Wnt抑制劑，從而促進Wnt/β-catenin信號通路的轉錄調控[20]，從而影響細胞增殖[21]。研究miRNA在生物節律中的具體靶點和調節網絡，將有助于更好地理解生物節律的調控機制。

4 結 論

本研究成功構建野生型和突變型雙熒光素酶報告載體，用雙熒光素酶檢測系統確定了miR-218靶向Nr1d2基因的3'UTR區域。