血清和尿NGAL、KIM-1、CysC對(duì)晚發(fā)型敗血癥新生兒急性腎損傷的早期預(yù)警價(jià)值

朱道謀，鐘麗花，陳彩華

(海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心 1.急診科，2.新生兒科，海南 海口 570000)

新生兒敗血癥是新生兒期嚴(yán)重的感染性疾病，易導(dǎo)致多器官衰竭和死亡[1]。尤其是晚發(fā)型敗血癥(late-onset sepsis，LOS)患兒(出生72 h后發(fā)生，多見于極低體重新生兒)，病情進(jìn)展迅速且腎損傷發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)比早發(fā)型敗血癥更高。目前關(guān)于 LOS患兒早期急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)診斷的相關(guān)研究數(shù)據(jù)尚少，血清肌酐測定和利尿監(jiān)測對(duì)于新生兒腎功能下降的評(píng)估具有一定的局限性[2]。尋找準(zhǔn)確、可靠、敏感、特異的新生兒AKI的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價(jià)值。其中血清和尿樣本中中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)[3]、胱抑素C(cystatin C，CysC)[4]、腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)[5]較其他指標(biāo)受到更多的關(guān)注。但是尚沒有研究系統(tǒng)比較血液樣本和尿液樣本NGAL、CysC、KIM-1對(duì)LOS患兒AKI的早期預(yù)警價(jià)值。在本研究中，我們將回顧性分析120例LOS患兒血清和尿NGAL、KIM-1及CysC水平與早期AKI發(fā)生的關(guān)系，并進(jìn)一步比較兩種樣本檢測對(duì)早期AKI預(yù)警的靈敏度、特異度的差異，從而為臨床檢驗(yàn)提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2017年10月至2019年12月我院收治的120例LOS患兒的臨床資料，所有患兒都是日齡3～14 d(中位日齡8 d)入住新生兒重癥監(jiān)護(hù)室，在出生≥72 h后懷疑局部感染(肺炎、泌尿道感染)或出現(xiàn)臨床異常表現(xiàn)(主要是高熱、呼吸窘迫、高膽紅素血癥和發(fā)育停滯等)，被臨床診斷為敗血癥；其中53例患兒并發(fā)兩個(gè)或兩個(gè)以上器官或系統(tǒng)功能障礙，出現(xiàn)血壓下降和(或)外周血灌注減少的癥狀，被診斷為嚴(yán)重?cái)⊙Y/敗血性休克。入選標(biāo)準(zhǔn)為胎齡≥34周，出生3 d以上，具備新生兒敗血癥的體征和癥狀。所有患兒均按照醫(yī)療標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行治療，血液和尿液樣本在-80 ℃保存用于進(jìn)一步生化分析。排除尿道系統(tǒng)畸形、先天性疾病和確診為嚴(yán)重圍產(chǎn)期窒息的患兒以及確診AKI之前死亡的患兒。120例LOS患兒中男76例，女44例，中位胎齡37周(34～41周)，中位出生體重2 780 g(1 320～4 790 g)，中位Apgar 1 min評(píng)分6分(3～8 分)，中位 Apgar 5 min評(píng)分8分(5～10分)。新生兒重癥監(jiān)護(hù)室住院原因包括高膽紅素血癥、發(fā)育停滯、呼吸窘迫和疑似感染。用改良AKIN分期系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估，將患兒分為分為AKI組(n=23)和非AKI組(n=97)。

1.2 AKI診斷標(biāo)準(zhǔn)

使用改良AKIN分期系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估：以入院當(dāng)天的血肌酐(serum creatinine，SCr)水平作為基礎(chǔ)值，入院48 h內(nèi)SCr值較基礎(chǔ)值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)；或者入院7 d內(nèi)經(jīng)推測或經(jīng)明確后新生兒出現(xiàn)腎損害，SCr升高至≥1.5倍基礎(chǔ)數(shù)值；或持續(xù)6 h的尿量<0.5 ml·kg-1·h-1。另外根據(jù)AKI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將患兒AKI程度分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)。Ⅰ級(jí)：48 h內(nèi)SCr值較基礎(chǔ)值升高≥26.5 mol·L-1(≥0.3 mg·dl-1)，或SCr升高至1.5～1.9倍基礎(chǔ)數(shù)值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持續(xù)6～12 h；Ⅱ級(jí)：SCr升高至2.0～2.9倍基礎(chǔ)數(shù)值，尿量<0.5 ml·kg-1·h-1且持續(xù)>12 h；Ⅲ級(jí)：SCr升高至≥3.0倍基礎(chǔ)數(shù)值，或Scr≥353.6 μmol·L-1，或無尿時(shí)間超過12 h。

1.3 檢測方法

(1) 所有新生兒在入院時(shí)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)室檢查，包括全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、葡萄糖、電解質(zhì)和血培養(yǎng)，以及必要的生化評(píng)估和動(dòng)脈血?dú)夥治觯贿€進(jìn)行了尿液分析和尿液培養(yǎng)。以上所有報(bào)告的數(shù)據(jù)均由我院檢驗(yàn)科醫(yī)師審核后出具。(2)血清和尿NAGL、CysC、KIM-1水平檢測：血液和尿液樣本在入院后2 d內(nèi)采集4次(0、12、24、48 h)，置于冰箱中直至離心。離心后將上清液在-80 ℃下保存。采用Maglumi2000電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和ELISA試劑盒檢測血清和尿中NGAL、CysC、KIM-1水平。NGAL試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司(板內(nèi)、板間變異系數(shù)分別為3.6%和7.9%)；KIM-1試劑盒購于瑞士澳斯邦公司(板內(nèi)、板間變異系數(shù)分別為4.4%和4.9%)；CysC試劑盒購于北京世紀(jì)沃德生物科技有限公司(板內(nèi)、板間變異系數(shù)分別為4.2%和7.2%)；Maglumi2000電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀購于深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組患兒一般資料比較

AKI組和非AKI組患兒的性別、胎齡、日齡、出生體重、Apgar 1 min評(píng)分、Apgar 5 min評(píng)分、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP、血清肌酐(SCr)、估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)等基礎(chǔ)資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AKI組患兒發(fā)生嚴(yán)重?cái)⊙Y/敗血性休克的比例高于非AKI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組LOS患兒一般資料的比較

2.2 兩組患兒入院2 d內(nèi)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平變化比較

采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析比較兩組患兒各時(shí)間點(diǎn)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平:(1)不同時(shí)間點(diǎn)血清和尿NGAL(F時(shí)間=19.241、37.385，P<0.001)、KIM-1(F時(shí)間=8.135、11.469，P<0.05)、CysC(F時(shí)間=6.544、9.308，P<0.05)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2) 兩組患兒血清和尿NGAL(F組別=25.736、78.915，P<0.001)、KIM-1(F組別=14.208、29.414，P<0.001)、CysC(F組別=8.717、13.218，P<0.05)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，入院后2 d內(nèi)AKI組患兒血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平均高于非AKI組(P<0.05)。(3) 兩組患兒血清和尿NGAL(F組別×?xí)r間=51.305、130.472，P<0.001)、KIM-1(F組別×?xí)r間=9.445、7.381，P<0.05)、CysC(F組別×?xí)r間=11.459、19.374，P<0.05)水平變化趨勢有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 兩組患兒入院2 d內(nèi)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平變化

2.3 多因素Logistic回歸分析LOS患兒繼發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素

以發(fā)生AKI作為因變量，將性別，胎齡，日齡，出生時(shí)體重，Apgar 1 min評(píng)分，Apgar 5 min評(píng)分，白細(xì)胞計(jì)數(shù)，CRP，SCr，eGFR，入院時(shí)尿NGAL、KIM-1、CysC水平等存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量納入回歸方程，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，尿NGAL、KIM-1及CysC水平升高是LOS患兒繼發(fā)AKI的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表3。

表3 LOS患兒繼發(fā)AKI的危險(xiǎn)因素

2.4 不同AKI分級(jí)患兒入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差異

根據(jù)AKI分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)分別有12、7、4例患兒，Ⅲ級(jí)組患兒血清NGAL水平及尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ級(jí)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同AKI分級(jí)患兒入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平差異

2.5 入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對(duì)AKI的預(yù)警效能

入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對(duì)LOS患兒AKI發(fā)生的預(yù)測價(jià)值分析見表5、圖1。尿NGAL的AUC大于血清NGAL，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-7.835，P<0.05)。而血清和尿KIM-1、CysC預(yù)測AKI的AUC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.315、-1.683，P>0.05)。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的AUC值均>0.7，提示血清和尿中這3個(gè)指標(biāo)的預(yù)警效能良好。Spearman相關(guān)分析顯示，血清和尿NGAL、KIM-1水平與實(shí)際結(jié)果的rs值均>0.4，且P值均<0.05，尤其是尿NGAL水平與實(shí)際結(jié)果的相關(guān)性最高。血清和尿NGAL、KIM-1、CysC經(jīng)H-L擬合優(yōu)度檢驗(yàn)，P值均>0.05，提示各指標(biāo)的預(yù)測效果與實(shí)際結(jié)果擬合度良好。

圖1 血清NGAL、KIM-1、CysC診斷LOS患兒早期AKI的ROC曲線

表5 入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平對(duì)AKI的預(yù)警價(jià)值

3 討 論

3.1 LOS與患兒AKI的關(guān)系

新生兒敗血癥是新生兒時(shí)期一種嚴(yán)重的感染性疾病，因病原體侵入新生兒血液中并且生長、繁殖、產(chǎn)生毒素而造成的全身性炎癥反應(yīng)[6]。新生兒敗血癥往往缺乏典型的臨床表現(xiàn)，但進(jìn)展迅速，病情險(xiǎn)惡，因此提高新生兒敗血癥的診斷水平具有重要的臨床價(jià)值。新生兒敗血癥分為早發(fā)型和晚發(fā)型。早發(fā)型多在出生后72 h內(nèi)起病，感染多發(fā)生于出生前或出生時(shí)，病原菌以大腸桿菌等格蘭陰性桿菌為主，多系統(tǒng)受累、病死率高[7]。而晚發(fā)型在出生72 h后起病，感染發(fā)生在出生時(shí)或出生后，病原體以葡萄球菌、肺炎克雷伯菌為主，多出現(xiàn)臍炎、肺炎等局部感染病灶[8]。與成人相比，新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房的新生兒患兒有著獨(dú)特的AKI危險(xiǎn)因素，這可能與不成熟的腎臟生理、母體環(huán)境、圍產(chǎn)期事件及醫(yī)源性損傷等有關(guān)。早產(chǎn)腎有一個(gè)出生后腎小球發(fā)生的短窗口，早產(chǎn)和足月腎都有一個(gè)固有的低腎小球?yàn)V過率(GFR)，易發(fā)生AKI[9]。敗血癥能夠通過不同的病理生理途徑引起AKI，在早產(chǎn)兒中新生兒敗血癥引起的AKI發(fā)病率更高，約為75.6%[10]。

3.2 AKI臨床常用診斷指標(biāo)的局限性

AKI是各種嚴(yán)重疾病中最常見的并發(fā)癥之一，早期診斷對(duì)于AKI的治療至關(guān)重要[11]。AKI以前被稱為急性腎功能衰竭，其定義是腎功能突然下降，伴有SCr水平的急性和可逆性升高，并且與尿量減少有關(guān)，易導(dǎo)致液體平衡、電解質(zhì)和廢物清除率紊亂。因此目前關(guān)于AKI的診斷基本是依賴于SCr水平的升高或尿量的減少，這兩者都是腎損傷的標(biāo)志性指標(biāo)。但是由于新生兒腎小管功能尚未發(fā)育完全，通常會(huì)出現(xiàn)非少尿性AKI，因此Ueno等[12]建議采用改良AKIN定義，不將尿量作為新生兒的診斷標(biāo)準(zhǔn)。AKI的早期診斷對(duì)于治療是至關(guān)重要的，但是連續(xù)測量SCr水平對(duì)于評(píng)估腎功能的下降程度具有一定的滯后性。而且SCr是作為一種反映腎功能情況的標(biāo)志分子，只是表示GFR降低后內(nèi)源性標(biāo)志物的積累情況，并不代表腎組織損傷程度[13]。此外，新生兒在分娩后前7 d SCr反映了母體肌酐成分的胎盤轉(zhuǎn)移，因此，新生兒SCr水平的升高通常在出生后前7 d持續(xù)存在，并且會(huì)隨著時(shí)間的推移而下降。目前大量的研究致力于制定一個(gè)更加標(biāo)準(zhǔn)化和準(zhǔn)確的AKI定義，以提高新生兒AKI的早期診斷率。

3.3 NGAL、KIM-1、CysC與AKI發(fā)生的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示，早期LOS患兒入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高對(duì)于繼發(fā)性AKI的發(fā)生具有一定的預(yù)警效能。AKI組患兒入院48 h內(nèi)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，并且升高趨勢相較于非AKI組更明顯；多因素Logistic回歸分析顯示，入院時(shí)血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平升高是LOS患兒繼發(fā)性AKI發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，且隨著AKI嚴(yán)重程度增加，Ⅲ級(jí)組患兒血清NGAL水平和尿NGAL、KIM-1水平高于Ⅰ級(jí)組。新生兒敗血癥被認(rèn)為是通過多種不同的病理生理途徑導(dǎo)致AKI。首先，全身炎癥反應(yīng)導(dǎo)致低血壓、腎低灌注和繼發(fā)性急性腎小管壞死。其次，微血管功能障礙被認(rèn)為是在腎血流量正常或增加的情況下發(fā)生的，表現(xiàn)為GFR降低和腎小管功能不全，這在組織學(xué)上與急性腎小管壞死不同。此外，腎盂腎炎通常伴有潛在的腎道異常和先天性感染，可導(dǎo)致AKI。在早產(chǎn)兒中，由于新生兒敗血癥引起的AKI的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于足月新生兒。眾多研究證實(shí)，與腎損傷有關(guān)的分子如NGAL、KIM-1、CysC可用于預(yù)測新生兒敗血癥繼發(fā)性AKI，但是其可靠性尚存有爭議。El-Farghali等[14]研究發(fā)現(xiàn)，非敗血癥(n=35)和敗血癥(n=25)危重患兒sNGAL水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但與無AKI組相比，AKI患兒sNGAL水平顯著升高，表明NGAL是AKI的標(biāo)志物，其水平升高并非敗血癥所致。此外，很多學(xué)者認(rèn)為一些AKI的新型標(biāo)志物如NGAL、KIM-1、CysC等，在直接反映腎臟損傷方面優(yōu)于SCr。Shang等[15]研究表明，NGAL與腎損傷密切相關(guān)，腎損傷患者尿和血清NGAL的表達(dá)顯著增加。KIM-1是一種黏附分子，也是一種跨膜蛋白，由334個(gè)氨基酸殘基組成，一般由受損的近曲小管上皮細(xì)胞所表達(dá)。在正常的腎組織中，KIM-1幾乎是不表達(dá)的，但是當(dāng)腎臟組織缺血或腎毒性損傷后，KIM-1在損傷后的近端小管中水平明顯上調(diào)。KIM-1可介導(dǎo)吞噬凋亡細(xì)胞并抑制免疫損傷和炎癥反應(yīng)等，進(jìn)而作為一種保護(hù)性細(xì)胞因子參與腎損傷修復(fù)過程[16]。因此，在腎小管早期損傷的時(shí)候，KIM-1的敏感性、特異性均較高。CysC是包含120個(gè)氨基酸的小分子堿性蛋白，其氨基酸序列在體內(nèi)表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，一般情況下其在血液中的濃度變動(dòng)很小。腎小管不主動(dòng)分泌CysC，但CysC可自由透過腎小球?yàn)V過膜，并且在近曲小管處被分解和重吸收，因此CysC水平變化也可反映腎小球?yàn)V過功能的損害[17]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)AKI組LOS患兒血清和尿NGAL、KIM-1及CysC的水平均顯著升高，并且在入院48 h內(nèi)持續(xù)升高。

3.4 血清和尿NGAL、CysC、NGAL水平對(duì)AKI的預(yù)警價(jià)值

本研究結(jié)果顯示，血清和尿NGAL、CysC、NGAL對(duì)于LOS患兒繼發(fā)性AKI都有一定的預(yù)警價(jià)值，且血清和尿NGAL、KIM-1、CysC的H-L擬合優(yōu)度檢驗(yàn)顯示，均P>0.05，提示各指標(biāo)的預(yù)測效果與實(shí)際結(jié)果擬合度良好。但是尿NGAL的預(yù)警效能大于血清NGAL，而且與實(shí)際結(jié)果的相關(guān)性更高；而血清和尿KIM-1或CysC對(duì)AKI的預(yù)警效能基本一致。NGAL被稱為lipocalin2，最初被描述為一種由多種人類細(xì)胞表達(dá)的癌基因，包括上皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，可通過腎臟被迅速排出，半衰期為10～20 min[18]。因此相較于血清NGAL，尿NGAL水平升高更能夠反映腎小管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷情況，但是并不能反映GFR的下降。此外NGAL也是中性粒細(xì)胞活化的重要標(biāo)志物，血清NGAL水平升高易受到其他炎癥感染因素的影響，因此若要進(jìn)一步證實(shí)尿NGAL相較于血清NGAL對(duì)LOS患兒繼發(fā)AKI的預(yù)警效能更高，則需要從NGAL的起源和作用機(jī)制、代謝特點(diǎn)等方面進(jìn)行更深入的分析。

綜上所述，LOS繼發(fā)性AKI患兒表現(xiàn)為早期血清和尿NGAL、KIM-1、CysC水平普遍升高，相較于血清NGAL，檢測尿NGAL水平對(duì)于AKI的預(yù)警效能更高，而對(duì)于KIM-1和CysC指標(biāo)，我們并未發(fā)現(xiàn)血清和尿預(yù)警效能的差異性。