脂肪干細胞分化為血管內皮細胞機制的研究進展

郭廷賢，陸無畏，郭芳芳

(東南大學附屬中大醫院 燒傷整形科，江蘇 南京 210009)

脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)是一種間充質干細胞，是從脂肪組織中分離得到的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞。已證實ADSCs可分化成多種細胞譜系，具備修復、維護或增強各種組織的潛力[1-2]。ADSCs來源豐富，分離、鑒定與培養較易操作，不存在應用胚胎干細胞時的倫理道德問題[3]。與其他干細胞比較，ADSCs在實際應用方面有著獨特優勢，是理想的血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VECs)來源。創面修復狀況會影響患者生活質量，一直是外科學中的熱點問題。VECs能促進受損組織血運重建及受損器官功能恢復[4]，但其來源是臨床應用的瓶頸。研究證實ADSCs在特定條件下可分化為VECs，將獲得的細胞注入受損組織可加快創面修復[5]。

1 ADSCs與VECs的鑒定

1.1 ADSCs的鑒定

ADSCs與其他間充質干細胞一樣均表達多向分化潛能細胞的標記分子，其功能的發揮在很大程度上依賴于表面表達的分子，同時這種表面標記分子也是鑒定細胞種類的重要標志。2013年，國際脂肪應用技術協會[6]宣布從人體中分離的ADSCs表型為CD31-/CD34+/CD45-/CD235a-，而經體外培養的ADSCs表型為CD31-/CD44+/CD45-/CD73+/CD90+/CD105+。

1.2 VECs的鑒定

VECs作為形成血管壁的細胞，通過參與血管新生、分泌一氧化氮(nitric oxide，NO)等血管舒張因子調節血管通透性，與血管中的成分相互作用在維持血管穩態中發揮極為重要的作用[7]。對于VECs的鑒定，國內外學者大都會從以下3方面[8-10]進行：(1) 形態學：鏡下成熟VECs具有特征性的鑲嵌狀鋪路石樣形態。(2) 細胞表面標記：成熟VECs其表型為CD31、血管內皮生長因子受體-2(VEGF-R2)、VECs鈣黏連蛋白(VE-Cadherin)表達陽性，同時胞漿內血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)染色陽性。(3) 細胞功能：成熟VECs應具備小管形成的能力，分泌NO，并攝取乙酰化低密度脂蛋白(acetylated low density lipoprotein，ac-LDL)。

2 ADSCs分化為VECs的誘導方法

誘導ADSCs向VECs分化的方法雖然很多，但主要是培養基誘導培養、共培養以及基因轉染3種方法。

2.1 培養基誘導培養

培養基誘導培養多采用直接誘導分化。Colazzo等[9]將培養至第3代ADSCs的培養基中添加50 ng·ml-1的血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)來誘導分化，經過7 d的培養，有15%的細胞內皮標記物呈陽性，這些細胞也能夠攝取ac-LDL，并在Matrigel成管實驗中形成管狀結構。劉琳等[10]在Colazzo等的實驗基礎上，加入了堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，b-FGF)進行聯合誘導培養，經過21 d的培養，發現被誘導的ADSCs的細胞形態向VECs轉化，呈鋪路石樣形態,VECs第Ⅷ因子相關抗原染色細胞陽性,透射電鏡下可見W-P小體(Weibel-Palade body)。以上都表明在誘導ADSCs向VECs分化時，培養基添加細胞生長因子具有積極的作用。Shang等[11]在誘導ADSCs向VECs分化時，設計了在培養基添加VEGF和骨形成蛋白-4(bone morphogenetic protein-4，BMP-4)，并聯合缺氧環境處理的誘導方法。結果表明，在添加VEGF的條件下，ADSCs就可以向VECs分化，但是分化率不高，而聯用BMP-4的細胞組分化程度較高，分化的細胞數量也顯著增加。值得注意的是，缺氧處理條件下的ADSCs不僅高度表達了VECs標記物，包括 CD31、VEGF-R2 和 VE-Cadherin，還顯示出體外血管生成的潛力，可以攝取ac-LDL并具備體外分泌NO的能力。

研究均顯示，在體外對ADSCs進行培養基定向誘導時VEGF是至關重要的，其作用促使ADSCs向VECs分化。但值得注意的是，當在培養基繼續添加血管發生相關的其他細胞因子時，ADSCs分化為VECs的程度往往會升高，與此同時獲得的VECs的數量也會增多[9-11]。

2.2 共培養體系誘導

焦自釗等[12]研究發現，將ADSCs和VECs以1∶1的比例在培養基上共培養，最終共培養上清液中VEGF、b-FGF濃度明顯高于VECs單獨培養組，同時ADSCs有明顯的向VECs分化趨勢，并具有VECs的形態,研究提示ADSCs可能通過直接分泌或間接作用來促進VECs分泌VEGF、b-FGF等細胞因子，進而影響VECs增殖及血管化，也改變了ADSCs的分化方向。最新研究中，石志康等[13]將兔的ADSCs和VECs共培養接觸，結果可見體外培養擴增的ADSCs呈梭形生長，VECs形態多樣，呈鋪路石樣。經免疫組化染色分析，發現ADSCs與VEC共培養組上清夜中VEGF、平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達明顯高于單獨培養組,該研究提示我們ADSCs和VECs經體外共培養可作為種子細胞參與組織工程用于增加組織血管的生成。

在這些共培養的研究中均發現共培養上清液可以檢測到VEGF的表達增加，ADSCs可以向VECs分化。

2.3 基因轉染定向誘導

關于使用基因轉染技術來進行定向誘導的方法，李江璇等[14]通過將攜帶 VEGF基因的慢病毒表達載體轉染于人ADSCs,檢測其培養基上清液中細胞生長因子的表達，結果顯示轉染VEGF基因后的人ADSCs可以分泌VEGF和b-FGF，培養基的上清液也可以提高VECs的增殖活力和遷移能力。同時還有研究者[15]將含有血小板衍生內皮生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)基因的慢病毒表達載體轉染于兔ADSCs，同時設置對照組，注入皮下觀察ADSCs的形態和其表達蛋白，結果顯示轉染了PDGF基因的ADSCs表達PDGF的數量明顯增加，同時皮下新生血管數量明顯增加，說明基因轉染的方法可促進ADSCs分泌細胞因子，同時促進ADSCs向VECs分化。

以上研究說明ADSCs具有向VECs分化的潛力，是VECs體外來源的理想途徑，誘導過程中VEGF尤為重要。只有對分化機制進行深入研究和探索，才能獲得高分化度、高成熟度、高轉化率的血管內皮種子細胞，進而為組織工程血管構建提供研究基礎。

3 ADSCs分化為VECs的相關機制

對誘導ADSCs向VECs分化機制的研究很多，近期研究主要涉及調節細胞表面蛋白受體、通過細胞攜帶外泌體和影響細胞信號轉導通路3個方面。

3.1 通過調節ADSCs表面酪氨酸激酶受體來影響分化方向

Mustonen等[16]研究發現，成熟VECs表面有3類主要的酪氨酸激酶受體及其配體家族(VEGF/VEGFR、Ang/Tie、Ephrin/Eph)，其在血管的生成中起到了相當重要的作用。Cheng等[17]研究發現，Eph的受體酪氨酸激酶的活化,在VEGF依賴的血管生成中具有重要作用，該實驗結果還顯示:(1) VEGF能誘導血管內皮上酪氨酸激酶受體EphrinA的表達和內源性EphA2受體活化磷酸化；(2)如果阻滯EphA受體的活性，會抑制VEGF依賴的血管形成。同時還有研究顯示,EphB的配體EphrinB2能抑制VEGF和血管生成素(angiopoietin-1，Ang-1)誘導的RAS/MAPK信號途徑,從而抑制VEGF和Ang-1誘導的動脈處VECs增殖和遷移[18]，這對動靜脈交界處毛細血管內皮正確的形態學發生是極為重要的因素。Shang等[11]成功誘導ADSCs向VECs分化，其潛在機制就是在低氧環境下EphrinB2的去甲基化，影響了后續相關的蛋白合成信號通路，促進了ADSCs向VECs的分化，可以進一步認為，影響ADSCs表面受體酪氨酸激酶的活性，可以定向促進ADSCs向VECs分化。

3.2 通過ADSCs外泌體攜帶物質來影響分化方向

外泌體是細胞胞膜系統通過主動分泌排出的一種直徑40～150 nm的盤狀小囊泡，同時外泌體具有和其來源細胞相同的生物學功能[19-20]。研究顯示，不同來源的外泌體其合成分泌的RNA具有不同的結構,產生特定的生物調控信息,從而影響機體生理過程[21-22]。張靜等[23]將收集到的ADSCs外泌體注入人臍靜脈VECs的培養液中，發現實驗組的細胞培養液中VEGF蛋白表達量明顯高于對照組；體外Matrigel成管實驗中，發現實驗組形成管狀結構明顯增多，提示ADSCs外泌體可以促進血管內皮的增殖、遷移及管樣結構形成。而張亞等[24]研究ADSCs分化成VECs前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達，發現了數個mi-RNA通過調控與干細胞的分化、細胞增殖和細胞周期調控、生長因子、轉錄因子、跨膜蛋白、結合蛋白等息息相關的靶基因，從而參與調控人ADSCs向VECs的分化過程。

以上研究表明，ADSCs外泌體攜帶的不同mi-RNA，通過影響后續相關靶基因的表達，可以誘導ADSCs向VECs分化，例如一項來自國外學者的研究就表明誘導前后ADSCs外泌體攜帶的mi-RNA的差異性表達，可以介導靶基因EphrinB2調控VEGF依賴的血管生成，同時可調節纖溶酶和基質金屬酶兩種蛋白的活性來調控ADSCs向VECs分化[25]。

3.3 通過影響ADSCs信號轉導通路來影響分化方向

許多研究表明，ADSCs具有多向分化的潛能，通過多種信號通路介導ADSCs可以分化為多種不同的細胞，主要包括成骨細胞、軟骨細胞、神經元、平滑肌細胞、淋巴管內皮細胞等[26-30]，同時具有向VECs分化的能力。Hellstrom等[31]研究顯示，VEGF信號通路的下游通路Dll4/Notch信號通路在調控新生血管形成上具有極其重要的意義，這也是VEGF在血管發生中發揮重要作用的基礎。而Kim等[32]也發現，BMP信號通路的下游通路Alk1-BMPRII / ActRII-ID1 / ID3通路在血管新生中起到了重要的調控作用，這也是Shang等[11]在誘導ADSCs向VECs分化時聯合使用VEGF和BMP-4的實驗基礎。殷令妮等[33]研究發現，低氧培養不僅可以刺激ADSCs增殖，還可以促進ADSCs向VECs分化，此過程是由PI3K/Akt信號通路介導發生，此通路還介導多種細胞因子如VEGF、PDGF的產生，進而促進ADSCs向VECs分化。

4 ADSCs定向分化為VECs的應用現狀

近些年來，隨著人們對于誘導ADSCs向VECs轉化的研究深入，ADSCs越來越多地被應用在血管組織工程之中。Volz等[34]研究認為，如何應對重度燒傷創面修復、畸形矯正術后和腫瘤切除術后的受損軟組織的替代，成為臨床上一個棘手的問題。盡管目前外科手術技術的不斷革新和諸多新型合成材料的應用在一定程度上緩解了這一情況，但在供體和受體部位的實際應用中仍存在大量局限性和并發癥，影響預后質量，因此迫切需要開發出新的方法以及材料允許永久替代自身軟組織[35]。ADSCs的誘導分化作為血管化脂肪組織工程的基本工具，應用其開發安全、高效的體外脂肪組織構建物成為了當今的技術熱點，尤其是脂肪組織工程血管化，在血管組織工程中具有更重要的地位。Kayabolen 等[36]開發出了一個具有良好機械性能的生物相容性的水凝膠支架，將脫細胞脂肪組織(decellularized adipose tissue，DAT)和纖維蛋白(Fibroin，Fib)以1∶3的比例混合制備水凝膠，該水凝膠支架是具有良好的支持VECs生存的脂肪組織構建物。Park等[37]在實驗中發現ADSCs引起的三維細胞團(three dimensional cell masses，3DCMs)發生了缺氧狀況，加速了VEGF的表達，促進了新生血管的生成，說明ADSCs的3DCMs可以用作新血管形成的VECs來源，也可以與其他細胞類型共同植入進行再生醫學研究。

目前來說，血管化脂肪組織工程是一個非常有前景的領域，期待著我們尋找到新的可誘導ADSCs分化為VECs的靶點，或者構建新的模型來進行血管組織工程。不過我們仍應當意識到，盡管ADSCs分化被視為再生醫學中新的干細胞療法的工具鑰匙，但仍需綜合宿主環境和患者相關因素，通過進一步研究以提高其效率及可應用性[38]。

5 展 望

ADSCs在促進創面愈合方面存有巨大潛力，尤其是血管脂肪組織工程化更是具有非常大的發展前景。但如何尋找到一個新的靶點，以及怎樣通過最新技術構建一個高效安全可利用的模型都是非常值得探索的。相信在不久的未來，隨著血管組織工程理論的不斷完善，我們可以結合最新的科學技術制作出應用于受損組織的安全、高性能的再生血管替代材料。