外周血單個核細胞miR-143表達對STEMI患者急診PCI術后1年發生支架內再狹窄的預測價值

趙玉君，孫宏超，王翠平，董自平，路桂杰

(1.任丘市人民醫院 心內科，河北 任丘 062552；2.華北石油總醫院 急診科，河北 任丘 062552)

經皮冠狀動脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)是冠心病患者一個里程碑式的治療方法，然而部分患者在PCI術后1年內會發生支架內再狹窄(in-stent restenosis，ISR)，尤其是裸金屬支架ISR發生率較高，雖然使用藥物洗脫支架可將ISR的發生率降低到5%～10%，但是仍不可避免[1]。球囊和支架可引起血管損傷進而導致動脈平滑肌細胞過度增殖，此外包被劑的非細胞特異性特征也損害內皮細胞，從而導致血栓形成或動脈粥樣硬化，造成晚期治療失敗[2]。最近的研究表明，一些微小RNA(microRNAs，miRNAs)可以作為預測或診斷疾病及不良事件的生物標志物[3]。miR-143是miRNAs家族的成員，位于5號染色體上，在血管平滑肌中大量存在[4]。已有研究證明，miR-143水平與誘導平滑肌細胞抗動脈粥樣硬化表型有關[5]。孟霖霖[6]發現循環miR-143/145水平與冠狀動脈病變嚴重程度呈負相關，可反映冠脈狹窄程度。然而關于miR-143是否參與動脈內皮細胞缺損尚缺乏直接的證據支持。基于上述信息，本研究旨在通過前瞻性研究，探討外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中miR-143表達對ST 段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)患者急診PCI術后1年發生ISR的預測價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取72例2019年3月至10月在任丘市人民醫院接受急診PCI術的STEMI患者作為研究對象，并定期隨訪至少1年，進行前瞻性巢式病例對照研究。以入院首次進行急診PCI作為研究起點，以隨訪期間發生ISR作為研究終點；采用巢氏病例對照研究法，將ISR患者定義ISR組。每當發生1例ISR，立即同時以患者年齡、性別、體重指數等基線信息作為匹配條件，按照1∶1從同隊列中選擇匹配的患者作為對照組。最終ISR組33例患者，非ISR組39例患者。經冠狀動脈造影證實ISR的診斷。冠狀動脈再狹窄定義為支架段再狹窄超過血管直徑的50%[7]。在PCI術后3 h內采集血液樣本，研究對象具有詳細和可追溯的醫療記錄，包括血生化、心電圖、冠狀動脈造影、心胸外科手術報告等，STEMI在患者的醫療診斷記錄中得到確認。排除標準：再狹窄診斷前再次植入支架者，患有嚴重的肝腎功能不全、感染、腫瘤、心力衰竭、透析、結締組織疾病等患者。應用血管內超聲(intravascular ultrasound，IVUS)觀察病理血管的變化。本研究經我院倫理委員會批準，所有患者均知情同意。

1.2 提取PBMCs并采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測PBMCs中miR-143含量

清晨空腹取5 ml外周靜脈血，用抗凝劑乙二胺四乙酸(EDTA)處理。用淋巴細胞分離液經Ficoll密度梯度離心分離，-80 ℃保存。37 ℃下快速復活，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩次。離心后吸去細胞上清，制備PBMCs供進一步使用。用Trizol(美國Invitrogen公司)從PBMCs中提取總RNA，使用紫外Nandodrop2000?分光光度計(美國Thermo Fisher公司)測定總RNA的濃度和純度，以總RNA為模板進行逆轉錄，并在-80 ℃低溫保存。每個樣品都重復分析3次。采用Taqman advanced mirna assay 和Taqman fast advanced master mix試劑盒(德國Qiagen公司)進行PCR擴增。循環條件：95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40個循環。用2-ΔΔCt法以U6為內參計算miR-143的相對表達量。miR-143正向引物5′-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3′，反向引物5′-GCCTGAGATGAAGCACTGT-3′；U6正向引物5′-GACGAATACCGGCGTGAGAA-3′，反向引物5′-AAATTCTGTTTGCGGTGCGT-3′。

1.3 其他實驗室指標檢測

每個受試者在我院檢驗科用分離膠促凝管取全血3 ml，使用離心機在2～8 ℃、2 000 r·min-1條件下處理30 min，分離血清，保存在-20 ℃或-80 ℃條件下，避免反復凍融處理。用ELISA試劑盒(上海通蔚生物公司)測定血清B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的水平。以水平軸為標準品濃度，垂直軸為光吸收值，用相關軟件繪制標準曲線，計算待測指標水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，試驗前所有試劑混合均勻。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組STEMI患者一般資料的比較

兩組患者的年齡、性別構成、高危因素(高脂血癥史、高血壓史、吸煙史和飲酒史)、體重指數、收縮壓(systolic blood pressure，SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、甘油三酯(triglyceride，TG)、隨訪期間用藥史等差異均無統計學意義(P>0.05)；ISR組患者糖尿病史比例、血糖、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)高于非ISR組，支架長度長于非ISR組，支架直徑小于非ISR組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般資料的比較

2.2 PBMCs中miR-143水平與ISR發生的相關性

與非ISR組(1.00±0.14)相比，ISR組患者PBMCs中miR-143相對表達量(0.62±0.21)顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。單因素和多因素 Logitic回歸分析顯示，排除5個臨床因素(糖尿病史患者比例、血糖、LDL-C、支架長度、支架直徑)干擾后，miR-143與ISR的發生風險有關(OR=6.367，95%CI2.434～13.679，P<0.05)。

2.3 PBMCs中miR-143表達對STEMI患者急診PCI術后1年發生支架內再狹窄的預測價值

經ROC曲線分析發現，PCI術后PBMCs中miR-143表達預測STEMI患者急診PCI術后1年發生支架內再狹窄的AUC為0.954(95%CI0.910～0.998)，cut-off值為0.795，在該閾值下靈敏度和特異度分別為94.9%和81.8%。見圖1。

圖1 PBMCs中miR-143表達預測STEMI患者急診PCI術后1年發生支架內再狹窄的ROC曲線

2.4 兩組患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平的比較

ISR組患者血清Bcl-2和IL-6水平高于非ISR組，差異有統計學意義(P<0.05)；兩組患者血清IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組患者血清Bcl-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β、TNF-α水平比較 pg·ml-1

2.5 PBMCs中miR-143表達與血清Bcl-2、IL-6水平的相關性

ISR組患者PBMCs中miR-143相對表達量與血清Bcl-2、IL-6水平呈負相關性(r=-0.739、-0.646，P<0.05)，血清Bcl-2水平與IL-6水平呈正相關性(r=0.801，P<0.05)。見圖2。

圖2 ISR組患者PBMCs中miR-143表達與血清Bcl-2、IL-6水平的關系

3 討 論

目前急診PCI術是臨床治療 STEMI 的最有效方法，STEMI 患者在接受 PCI 手術后冠狀動脈的血流恢復，預后改善，但是ISR依然是PCI治療技術的致命弱點[8]。近年來，盡管我們已經對ISR進行了臨床和基礎研究，并在風險預測、預防和治療方面取得了重大進展，然而強化的抗血小板和他汀類藥物治療以及嚴格的術后處理似乎不能有效預防部分患者ISR的發生。因此越來越多的學者開始考慮基因方面的原因[9]。miRNAs是一類進化上高度保守、內源性單鏈、非編碼的小分子RNA，因其在循環血液中的穩定性以及相對的細胞和(或)組織特異性，為檢測遺傳背景差異提供了一種簡便的方法。miR-143位于人類5號染色體上，在造血、免疫、炎癥、癌癥和心血管疾病中發揮重要作用。Zhou等[10]研究發現，miR-143與膿毒癥患者免疫炎癥反應密切相關。PBMCs是從外周血中分離出來的單個核細胞，由 T、B淋巴細胞，巨噬細胞和自然殺傷細胞組成，在免疫應答中起著重要作用。在本研究中，我們發現ISR組患者PBMCs中miR-143相對表達量低于非ISR組，miR-143表達降低的STEMI患者PCI術后存在較高的ISR發生風險，與其他因素無關。

ISR的基本機制是血小板、白細胞和巨噬細胞聚集，導致中膜平滑肌細胞遷移和增殖。最近，研究人員發現約1/3的ISR事件是由于支架內新生動脈粥樣硬化，這明顯不同于傳統的機制[11]。然而，在這些機制中確實存在一個共同的現象，即ISR和支架內新生動脈粥樣硬化。以往的研究證實，miR-143在血管平滑肌細胞中呈高度特異性表達，并且在VSMCs的增殖和遷移過程以及動脈功能中發揮重要作用[12]。而且在冠狀動脈受損或動脈粥樣硬化的動物模型中，如ApoE基因敲除小鼠的動脈粥樣硬化、小鼠結扎誘導的頸動脈和大鼠頸動脈球囊損傷中，miR-143表達同樣顯著下降[13]。miR-143是位于人類5號染色體上的多功能 miRNA。Zhang等[14]證實 miR-143通過促進記憶T細胞分化和代謝重編程，增強T細胞的抗腫瘤作用；Vatandoost等[15]證實PBMCs與全身器官保持密切的聯系，因此可能表現出與胰島素靶器官有關的 miR-143改變，與正常健康對照組相比，糖尿病前期和明顯糖尿病期患者PBMCs中miR-143表達顯著降低。上述研究均證實miR-143與炎癥及免疫密切相關，可調節免疫細胞的活化和免疫因子的釋放。本研究中我們也證實ISR患者血清PBMCs中miR-143相對表達量較非ISR組患者降低，并且miR-143低表達是STEMI患者PCI術后發生ISR的獨立危險因素。這些結果提示 miR-143參與了動脈粥樣硬化的免疫炎癥反應機制。

成熟的 miRNA是由一系列核酸酶切斷長初始轉錄物而產生的。miR-143是 miRNA分子的一種，而Bcl-2是miR-143的直接靶向因子。陳玉婷等[16]研究證實，冠心病患者PCI術后血清Bcl-2水平明顯升高，且血清Bcl-2高表達可能是ISR的一個重要原因，藥物綜合治療可使冠心病患者血清Bcl-2表達下調，進而有效地預防ISR的發生。ISR的發生與血管平滑肌細胞過度增殖和炎癥刺激有關。Elia等[17]體外和動物研究發現，miR-143表達缺失可導致血管平滑肌細胞分化不完全，進而引起主動脈結構改變，說明miR-143在平滑肌細胞分化過程中起著關鍵作用，并強烈提示它參與了平滑肌細胞分化表型的逆轉，這種逆轉發生于平滑肌細胞分化過程中的多種血管疾病，包括ISR[18]。本研究中，我們發現PBMCs中miR-143低表達與血清Bcl-2和IL-6高表達有關，說明miR-143低表達可能是引起血管平滑肌細胞凋亡及血管內皮炎癥反應的重要機制之一。

綜上所述，STEMI患者PBMCs中miR-143低表達是PCI術后1年發生ISR風險的獨立危險因素，其表達水平降低與血清Bcl-2和IL-6水平升高有關，因此上調PBMCs中 miR-143表達有望成為一個有效預防ISR的靶點。但是本研究存在一定的局限性，例如我們無法確定藥物治療對miR-143水平的影響，從而導致本結果可能存在一定偏差。進一步的研究應該旨在揭示某些藥物治療與PBMCs中miR-143水平變化及相關預后的關系。