攀枝花不同海拔高度烤煙農田紅壤中氨氧化細菌與氨氧化古菌的群落結構分析

張 靜,楊 鵬,余 偉,張亞潔,封 俊,閆芳芳,張宗錦,辜運富,*

1 四川農業大學資源學院, 成都 611130 2 四川省煙草公司攀枝花市公司, 攀枝花 617099

氮素循環是自然生態系統重要的物質循環過程,由微生物代謝驅動的多種生物化學反應所組成[1]。土壤氮循環與植物生產力密切相關。土壤生態系統中,硝化過程是土壤氮循環的重要環節,其中,微生物驅動的氨氧化過程是硝化作用的第一步和限速步驟,對植物生長所需的氮元素起著關鍵作用[2]。氨氧化過程中發揮關鍵作用的是編碼氨單加氧酶的amoA基因,可將NH3氧化成NH2OH,供植物吸收利用[3]。土壤氨氧化的主要功能菌群為氨氧化細菌(Ammonia-oxidizing bacteria, AOB)和氨氧化古菌(Ammonia-oxidizing archaea, AOA)[4- 5]。AOA和AOB在海洋[6]、土壤[7]和淡水[8]等生態環境中的廣泛分布,更表明了其在硝化過程中的主導地位[9]。因此探究生態系統中AOA與AOB群落結構的差異及其與環境因子的關系對深入認識生態系統氮素生物地球化學循環特征及其微生物學機制具有重要意義。

近年來,土壤氨氧化微生物群落的地理分布及驅動因素的研究受到廣泛關注。路璐等(2018年)研究表明,在土壤理化性質和硝化潛勢顯著差異的不同林分土壤中,氨氧化微生物群落結構存在明顯的分異特征,土壤總氮和有機質為主導驅動因子[9]。王曉胡等研究發現,貢嘎山不同海拔梯度氣候和土壤性質的綜合作用可能是引起AOA和AOB數量及豐度變化的因子,且AOA和AOB數量具有極強的空間異質性[10]。AOA與AOB是影響土壤氮循環的重要因素,其群落結構受到不同養分因子的影響,關于不同生態環境中AOA與AOB 分布規律的研究已有較多報道,但由于研究區域的不同,得出的結論也有所差異。目前針對干熱河谷區海拔對農田土壤AOA與AOB群落結構影響的研究還相對較少[9- 11]。

攀枝花地處干熱河谷山地地形區,區域內的氣候、植被和土壤理化性質沿海拔呈現出規律的變化。同時,該地常年為烤煙種植區,因化肥施用不當導致土壤退化、板結,土壤環境惡化,煙葉品質下降。研究表明,氮素中的硝態氮與銨態氮含量對煙草的生長、產量及品質具有非常重要的作用,由AOA與AOB驅動的硝化作用在氮素循環過程中起著關鍵作用[12]。因此,攀枝花不同海拔高度烤煙農田紅壤區為開展AOA、AOB與環境相互作用的研究提供了理想場地[10]。隨海拔升高、溫度降低等環境條件可能對AOA與AOB生存適應性和群落結構產生一定的影響[13]。因此本文以攀枝花米易縣干熱河谷地區農田紅壤為研究對象,運用化學分析和末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)分析該區域不同海拔高度農田紅壤AOA和AOB群落結構的差異及其養分驅動因子,為深入研究該區域不同海拔高度紅壤氮素循環過程和土壤培肥管理等提供依據。

1 研究區域與樣地概況

攀枝花米易縣地處四川省西南部,青藏高原東南邊緣,安寧河谷下游,北緯26°42′—27°10′,東經101°41′—102°15′,為亞熱帶干熱河谷氣候,雨熱同期,光照時數 2217.3—2413.5 h,熱量、光照充足,年降雨量1100 mm,降水豐沛[14]。主要土壤類型為酸性紅壤[15]。

于2019年4月在米易縣坪山鄉3個海拔高度：1600 m,1800 m,和2000 m的紅壤農田耕作區進行土樣采集,種植制度為雨季(4—9月)種植烤煙,旱季空閑(10月至第二年3月),烤煙品種為云煙87。在每個海拔高度分別設置6個采樣區,采樣區大小約為50 m×50 m,且之間至少間隔100m。在每個采樣區按“五點采樣法”原則進行表層土壤(0—20 cm)的采集,采樣時先去除根和砂礫等雜質、充分混勻,然后裝入無菌采樣帶并放置于冰盒中帶回實驗室。將土樣分成2份,一份自然風干后磨碎過20目篩后用于土壤理化性質分析,另一份新鮮樣品立即進行土壤總DNA的提取。

2 材料和方法

2.1 土壤理化性質測定

2.2 土壤總DNA的提取

利用 Fast DNA? SPIN Kit for Soil試劑盒,按照試劑盒說明書給定操作步驟進行土壤總 DNA 的提取,經瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度后,置于-20 ℃冰箱中保存備用。

2.3 末端限制性片段多態性分析(T-RFLP)

采用ABI PCR 9700 擴增儀進行擴增。每對正向引物5′末端帶有 6-FAM 熒光標記。AOA和AOB引物分別為Arch-amoAF/Arch-amoAR(5′-ATGGTCTGGCTAAGACGMTGTA/ GCGGCCATC- CATCTGTATGT- 3′)和amoA- 1F/amoA- 1R(5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG/ GCGGCCATCCATC-TGTATGT- 3′)[10]。AOA功能基因擴增反應體系(25 μL)如下：2×PCR Master Mix(ABI,USA)12.5 μL,引物各 0.5 μL,DNA模板3 μL,無菌雙蒸水補足至25 μL。AOB功能基因擴增體系(25 μL)如下：2×PCR Master Mix(ABI,USA)12.5 μL,引物各 0.5 μL,DNA模板 3 μL,無菌雙蒸水補足至25 μL。PCR擴增反應程序如下：94 ℃預變性 5 min;94 ℃變性 1 min,53 ℃ 退火1 min,72 ℃延伸 1 min,共34個循環；72 ℃最終延伸 10 min。

擴增后的PCR產物用限制性內切酶(HhaI)進行酶切,酶切體系：PCR產物10 μL,無菌雙蒸水18 μL,10 x Buffer Tango 2 μL,HhaI2μL。37 ℃酶切16h,之后在80 ℃失活30min。將酶切產物送至生工生物有限公司進行毛細管電泳測定。

2.4 數據處理

通過 SPSS25.0 軟件的單因素方差分析(ANOVA)檢測不同海拔高度土壤理化性質的差異(P<0.05)。運用Excel 2010計算對AOA和AOB的多樣性指數及群落結構[17]。使用CANOCO5.0軟件對AOA與AOB進行非度量多維尺度分析(Non-metric Multidimensional Scaling, NMDS)及冗余分析(redundancy analysis,RDA)。

3 結果與分析

3.1 海拔高度對土壤理化性質的影響

由表1可知,隨海拔高度的增加,土壤理化性質總體上呈現降低的趨勢。三個海拔高度的土壤均呈弱酸性(pH5.5—6.5),與海拔1600 m的土壤相比,pH隨海拔高度增加而增加,但均未達到顯著差異。土壤有機碳、全氮和速效鉀含量隨海拔升高而降低,且在1600 m與2000 m的土壤達到顯著差異(P<0. 05)。堿解氮和有效磷含量隨海拔的升高呈先增加后降低的趨勢,但均未達到顯著差異。銨態氮含量在低海拔(1600 m)的土壤中含量最高,但各海拔高度之間無顯著差異(P>0.05),而硝態氮含量在中海拔(1800 m)的土壤中含量最高,且與其他兩個海拔高度差異顯著(P<0. 05)。海拔高度的變化在一定程度上改變了土壤環境,尤其是對土壤有機碳、全氮、速效鉀及硝態氮影響較大?？傮w而言,中等海拔的土壤具有較高的肥力水平。

表1 攀枝花干熱河谷不同海拔高度農田土壤的理化性質

3.2 海拔高度變化對土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落結構的影響

3.2.1不同海拔高度土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落結構的變化

不同海拔高度AOA、AOB群落NMDS分析結果如圖1所示,AOA與AOB群落結構隨海拔高度變化表現出不同的變化規律,AOA的群落結構較AOB分異明顯。AOA群落在各海拔內聚集相對集中,在三個海拔的群落結構相對獨立,表明不同海拔高度下AOA群落結構分異明顯。而在不同海拔高度下AOB分異變化更大,1600 m和1800 m的AOB群落集中且部分重疊,在2000 m時,AOB群落與1600 m和1800 m間隔較大?？傮w而言,不同海拔高度下AOA群落結構較AOB群落結構分異更明顯。

圖1 同海拔高度下AOA和AOB群落結構差異圖Fig.1 Community structure variation of AOA and AOB at different elevations

3.2.2海拔高度變化對氨氧化古菌和氨氧化細菌群落多樣性的影響

由表2可知,海拔高度變化影響土壤AOA和AOB群落的多樣性。就AOA而言,多樣性指數隨海拔高度的增加而增加,在高海拔(2000 m)的土壤中達到最大值。與低海拔(1600 m)的土壤相比,Shannon多樣性指數在2000 m時達到顯著差異(P<0.05),豐富度在1800 m時達到顯著差異(P<0.05),均勻度隨海拔的增加無顯著變化。而海拔高度變化對AOB多樣性指數的影響有所不同,AOB的Shannon多樣性指數和均勻度隨海拔的增加呈先增加后降低的趨勢,在中海拔(1800 m)土壤中最高,顯著高于低海拔土壤(P<0.05),而豐富度隨海拔的增加呈先降低后增加的趨勢,在中海拔(1800 m)土壤中最低,顯著低于其他兩個海拔的土壤(P<0.05)。此外,三個海拔高度的土壤中,AOA的多樣性指數均高于AOB。

表2 不同海拔高度下紅壤中 AOA 和 AOB多樣性指數

3.2.3氨氧化古菌和氨氧化細菌群落組成對海拔高度變化的響應

對不同海拔高度的土壤AOA和AOB群落結構進行T-RFLP分析(如圖2),結果表明, 在三個海拔高度的土壤中,AOA的T-RFs多于AOB。其中, 260bp、270bp的T-RFs是AOA中的優勢片段,相對豐度分別為2%—11%、5%—12%。270bp的T-RFs隨海拔增加呈現先增加后減少的趨勢。260 bp的T-RFs隨海拔地增加呈先減少后增加的趨勢。通過從NCBI網站中數據庫的比對發現,270 bp的T-RFs屬于亞硝基球菌屬(Nitrososphaera),而其余大部分T-RFs片段未能找到明確的類別。AOB 酶切后得到6個T-RFs片段,60 bp的T-RFs是三個海拔梯度的優勢片段,相對豐度分別為45.60%、45.51%、43.84%。65bp的T-RFs在3個海拔中的相對豐度為19.52%、17.45%、25.77%。其中,60 bp、65bp和80 bp的T-RFs 分別為亞硝化螺菌屬 (Nitrosospira)、亞硝化單胞菌屬 (Nitrosomonas)和硝化弧菌屬 (Nitrosovibrio)。

圖2 不同海拔高度下AOA和AOB基因末端限制性片段(T-RF)的相對豐度對比Fig.2 Comparison of relative abundance of AOA and AOB terminal restriction fragment (T-RF) under different treatments

3.3 不同海拔高度紅壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落結構相對豐度與土壤理化性質之間的關系

對AOA和AOB群落結構相對豐度與土壤理化性質之間的RDA結果如圖3所示,圖中箭頭表示養分因子,箭頭所處的象限表示養分因子與排序軸間的正負相關性,箭頭連線長度表示該養分因子與樣本分布相關程度的大小,箭頭連線間的夾角代表養分因子間的相關程度[18]。第一軸與第二軸分別解釋了16.44%和14.70% AOA的群落結構相對豐度變化,61.94%和6.95% AOB群落結構相對豐度變化。不管是AOA還是AOB,均與土壤速效鉀、有機碳和硝態氮顯著相關(圖3),顯示土壤硝態氮、速效鉀和有機碳是影響攀枝花干熱河谷農田紅壤AOA和AOB群落結構變異的主要養分因子。

圖3 不同海拔高度紅壤中氨氧化微生物 AOA和 AOB與養分因子變化的 RDA 排序Fig.3 RDA sequencing of AOA and AOB and nutrient factors in red soil at different altitudesSOC為有機碳,TN為全氮,AN為堿解氮,AP為有效磷,AK為速效鉀,為硝態氮,銨態氮

4 討論

不同海拔高度下氣候等因素的影響通過改變土壤理化性質直接影響AOA、AOB的群落結構組成及豐度。研究表明,土壤有機質、pH、有效氮、有效磷及有效鉀等理化指標均與海拔呈顯著的相關性[11]。李相楹等在研究不同海拔高度下梵凈山土壤碳、氮、磷分布特征時表示,土層中有機質與海拔高度顯著相關,有機質含量隨海拔高度增加呈先增加后降低趨勢,這主要是因為伴隨海拔高度增加,土壤溫度和水分降低,且植被豐富度和地上生物量也降低所致[19]。但王琳等研究顯示,隨海拔高度增加水分適宜但溫度較低,土壤微生物活動受到抑制,利于有機質的積累[20]。此外,土壤有機質含量還受其他因子的影響。本文中,隨海拔高度增加,土壤有機碳逐漸降低,這在很大程度上也是由于海拔升高改變了土壤溫度和水分含量,而導致土壤有機質含量降低。土壤有機質的變化直接會影響土壤多種營養元素的含量,有機質分解釋放氮、植物生長消耗氮,因此,隨海拔高度的上升土壤全氮含量也是呈現逐漸降低的趨勢[21]。但是斯貴才對藏東南森林土壤微生物群落結構與土壤酶活性隨海拔梯度變化時表示土壤中硝態氮隨海拔高度增加無顯著變化[22]。而本文中,硝態氮含量隨海拔高度增加呈先增加后減少趨勢,在中海拔(1800 m)與高海拔(2000 m)和低海拔(1600 m)差異顯著。這可能是因為在中海拔高度降雨較少,硝態氮不易隨水分流失,從而導致在中海拔高度土壤中硝態氮含量較其他海拔差異顯著。綜上所述,海拔高度變化對土壤理化性質影響較大。

Zhang等研究發現,土壤中AOA、AOB群落組成及相對豐度伴隨海拔升高呈現不同的變化規律。在較低海拔土壤中,AOA群落組成及相對豐度明顯高于AOB；而在高海拔土壤中,AOB群落組成及相對豐度明顯高于AOA[23]。但王曉胡對貢嘎山不同海拔梯度土壤氨氧化微生物數量空間分異特征中表示,AOA、AOB豐度在低海拔土壤中無顯著差異,但在高海拔土壤中AOA數量明顯高于AOB[10]。本文中,在三個海拔高度中,AOA群落組成及相對豐度均高于AOB。Leininger及賀紀正等研究發現在大多數酸性土壤中,AOA的群落組成及豐度高于AOB[24- 25]。本文中土壤pH呈現弱酸性,因AOA對酸性環境下相比AOB具明顯的競爭優勢,從而使得AOA豐度較AOB更高。此外,AOA多樣性指數隨海拔升高而增加,而AOB多樣性隨海拔高度增加呈先增加后減少趨勢。在Di等研究中發現AOA和AOB生長的土壤氮素含量不同,AOA傾向于低氮環境而AOB對高氮環境更適應[26]。本文土壤全氮含量隨海拔升高而降低,一定程度上對AOA所需的低氮環境更接近；而硝態氮在中海拔(1800 m)與高海拔(2000 m)和低海拔(1600 m)差異顯著,且隨海拔升高呈先增加后降低趨勢,因此在中海拔(1800 m)時更接近AOB所需的高氮環境?？傮w而言,AOA群落組成及相對豐度較AOB豐富,隨海拔高度增加,AOA、AOB多樣性呈現不同的變化規律。

研究表明,土壤理化性質與AOA、AOB群落結構及相對豐度有一定的相關性,并且能夠影響土壤AOA、AOB的數量[27]。土壤中增施氮肥可以提高AOA和AOB的豐富度及多樣性[28]。楊亞東在研究施氮肥對華北平原土壤氨氧化細菌和古菌數量及群落結構的影響時發現,增施銨態氮顯著改變了AOA和AOB的群落結構且對AOA數量的影響更為顯著[29]。而Di等研究認為AOA的數量不會隨著銨態氮肥的施加而變化,但AOB數量與硝態氮含量呈顯著正相關[26]。本文中通過冗余分析(RDA)發現,不論是AOA還是AOB的群落結構和相對豐度都與土壤中硝態氮含量顯著相關。與楊亞東的研究結果一致。Subrahmanyam等研究發現AOA對氨氮的親和力較AOB高,顯示出AOA在氨氧化過程中具有更高競爭能力[30]。本文中,隨海拔高度增加土壤中全氮含量總體呈現降低趨勢,AOB生長所需養分含量減少,從而AOB的群落結構相對豐度降低,這與AOB對高氮更有耐受力的觀點一致。羅培宇等在研究長期施肥對棕壤AOA、AOB豐度的影響時發現速效鉀與土壤中AOA、AOB豐度呈正相關[31]。這是因為長期耕作、施肥等對農田土壤的化學性質產生改變,從而影響了AOA、AOB的群落結構及相對豐度對環境的不同響應。與本研究結果相似,顯示速效鉀同樣是影響干熱河谷區域農田紅壤AOA和AOB群落結構發育的重要養分因子。

5 結論

本文運用化學分析和末端限制性片段長度多態性對攀枝花干熱河谷區不同海拔農田紅壤的養分特性和AOA及AOB群落結構進行了分析。結果顯示該區域的農田紅壤均呈弱酸性,土壤養分、AOA及AOB群落結構和多樣性均隨海拔升高出現明顯變化。伴隨海拔高度增加,AOA多樣性增加而AOB則是先增加后降低。AOA以亞硝基球菌屬(Nitrososphaera)為優勢菌群而AOB中優勢菌群為亞硝化螺菌 (Nitrosospira),二者相對豐度值隨海拔高度增加表現為先增加后降低的趨勢。土壤硝態氮、速效鉀和有機碳是影響該區域AOA與AOB群落結構變化的主要養分因子。

致謝：感謝中國科學院成都生物研究所李超男博士對數據分析的幫助,感謝攀枝花市煙草公司對采樣的幫助。