馬來酸噻嗎洛爾治療血管瘤的作用機制探討

趙 蓓，周夕湲，梁成琳，張麗霞

(四川省醫學科學院·四川省人民醫院皮膚病性病研究所，四川 成都 610072)

血管瘤屬于良性腫瘤，可發生于全身各處，女性的發病率要高于男性。嬰幼兒型血管瘤是小兒最常見的良性腫瘤[1]。然而，傳統治療在臨床應用方面的總體療效并不令人滿意，迫切需要更為有效的治療手段和干預措施。leaute-labreze等在2008年首次報道嘗試普萘洛爾用于嬰幼兒血管瘤治療后，逐漸引起了各國學者的關注[2]，為血管瘤的治療提供了新途徑。目前β-受體阻滯劑在嬰幼兒血管瘤治療中逐漸得到應用[3]。然而，β-受體阻滯劑作為替代激素的一線治療藥物，其治療血管瘤的作用機制、適應證及安全性等問題一直是從事血管瘤研究的基礎和臨床工作者們關注的重點[4，5]。血管瘤中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)較正常組織及消退期血管瘤表達明顯增高。如果能通過相關通路驗證經過β-受體阻滯劑治療后使得VEGF分泌減少，探究到馬來酸噻嗎洛爾作為β-受體阻滯劑的可能作用機制，則可為血管瘤的臨床用藥和進一步機制研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集四川省人民醫院病理科2018年6月至2019年6月血管瘤新鮮組織18例，來自手術切除的血管瘤患者，其中男11例，年齡(36.2±11.2)歲，女7例，年齡(26.5±10.6)歲；患者均符合中華醫學會2019年頒布的《血管瘤和脈管畸形的診斷及治療指南(2019 版)》中的相關診斷標準[6]。

1.2 方法

1.2.1瘤體細胞培養 參考文獻制備腫瘤細胞懸浮液[7]，使用PBS洗滌新鮮的血管瘤組織樣品并轉移到無菌培養皿中。將組織切碎成細塊狀(1 mm×1 mm)并再次用PBS洗滌。然后將組織用2 mg/ml膠原酶(Invitrogen，CA)消化至少2小時，在37 ℃下振蕩。通過使用移液管尖端重復吹打將細胞分散，并通過100 μM尼龍細胞過濾器過濾。將細胞以2×105的密度接種在低附著培養皿上使用干細胞培養(SCC)培養基(Invitrogen，CA)的細胞/ml，由Knockout DMEM，15%Knockout血清替代物，1×非必需氨基酸(NEAA)和20 ng/ml兩種堿性成纖維細胞組成。生長因子(bFGF)和人內皮生長因子(hEGF)。腫瘤球大約每7天傳代1次(大約200個細胞/球)；用PBS洗滌球體1次，然后通過與2 mg/ml膠原酶IV在37 ℃溫育10分鐘制備單細胞懸浮液。

1.2.2Western blotting 檢測VEGFR表達收集血管瘤組織和瘤旁組織，使用PBS進行清洗，提取總蛋白進行Western blotting實驗。VEGFR抗體購自CST公司(貨號Cat：#2479)，稀釋比例1∶1000。使用GAPDH為內參照，GAPDH一抗購自CST公司(貨號Cat：#5174)，稀釋比例為1∶5000。

1.2.3定量PCR(Real time-PCR) 檢測CDC42，MAPK，PI3K基因表達情況將腫瘤球接種到培養皿上，并在細胞培養基中暴露于0、2、4 nM馬來酸噻嗎洛爾(參見方法，IH腫瘤球培養物)10天，進行細胞計數。在培養的第5天收集添加0、2 nM馬來酸噻嗎洛爾的腫瘤球細胞，通過膠原酶IV解離成單個細胞并計數細胞數。每個樣品一式三份進行RT-PCR試驗。進行總RNA提取，逆轉錄成cDNA，之后進行定量PCR。體系(總體積10 μl)如下：cDNA1 μl，Primer(50 pM)上下游各0.1 μl，2×PCR MIX (Roche)，ddH2O 3.8 μl。定量PCR退火溫度60 ℃，40個循環。

1.3 統計學方法采用SPSS 18.0進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血管瘤組織細胞培養和VEGFR表達檢測VEGFR在血管瘤組織細胞中表達明顯高于瘤旁中的表達(P<0.01)。見圖1。

圖1 VEGFR在血管瘤組織中的表達 a.血管瘤和瘤旁組織VEGFR和GAPDH Western blotting原始電泳條帶圖；b.血管瘤組織VEGFR表達 **與瘤旁組比較，P<0.01。

2.2 RT-PCR結果通過對馬來酸噻嗎洛爾作用時間和作用濃度分析，實驗結果發現，培養的瘤體球細胞進行第0、5、10天的細胞計數表明添加了不同濃度的馬來酸噻嗎洛爾(0、2、4 nM)對腫瘤球細胞的生長具有抑制作用，見表1。

表1 不同時期不同濃度的馬來酸噻嗎洛爾對腫瘤球細胞數

2.3 馬來酸噻嗎洛爾對VEGF合成的通路中的關鍵基因表達量的影響根據實驗結果，我們選取中間點第5天添加馬來酸噻嗎洛爾分別為0 nM和 2 nM的腫瘤球細胞進行基因表達量的驗證。馬來酸噻嗎洛爾對腫瘤球細胞中所有驗證基因表達量均出現了下調，CDC42、MAPK、PI3K基因表達水平均明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2nM馬來酸噻嗎洛爾對血管瘤培養細胞CDC42、MAPK、PI3K表達的影響

3 討論

血管瘤是小兒最常見的由血管內皮細胞大量增生引起的良性腫瘤。VEGF作為血管內皮細胞特異性生長因子，作用于血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的增殖，參與血管瘤的發生和發展[5]。既往研究提示VEGF是血管瘤的作用靶點之一。

目前血管瘤的治療方式包括手術、藥物、同位素、激光等。而作為藥物治療的一種方法，應用β-受體阻滯劑治療嬰幼兒血管瘤的安全性和有效性較好，有效率60%～90%，其中以普萘洛爾最為廣泛。但是該藥具有較高的脂溶性，易通過血腦屏障，臨床上部分患兒可出現神經系統反應。理論上，局部用藥具有降低藥物使用劑量，增加局部組織藥物濃度，以及使用更方便、副作用更少等優點，但也受藥物劑型、透皮吸收能力等影響較大。根據有學者Meta分析的結果[8]，噻嗎洛爾局部外用治療血管瘤的療效較明顯，和口服普蔡洛爾治療血管瘤效果統計學上無顯著差異。馬來酸噻嗎洛爾作為β-受體阻滯劑，可能通過抑制G蛋白偶聯的cAMP依賴蛋白激酶(PKA)的激活，從而抑制ERK/MAPK通路的激活，使VEGF分泌減少，降低血管瘤的成血管能力[9，10]。我們選取ERK/MAPK通路上的某些關鍵基因進行表達量的驗證。從細胞生長結果中非常明顯揭示了噻嗎洛爾能夠有效抑制血管瘤細胞VEGF的表達，說明噻嗎洛爾是作用很強的非選擇性β受體阻滯劑。下游表達基因PI3K的表達量減少說明激活G蛋白/MAPK級聯的激酶利用率下降，G蛋白偶聯受到抑制，從而抑制下游 MAPK 通路[11，12]。本研究結果提示馬來酸噻嗎洛爾可能通過抑制G蛋白偶聯，并且抑制ERK/MAPK通路的激活，使得VEGF分泌減少。

本研究初步揭示了馬來酸噻嗎洛爾抑制血管瘤細胞VEGF分泌的初步作用機制。這也提示我們是否可從ERK/MAPK通路上進一步尋找更多可能的藥物作用靶點基因，通過聯合用藥或增加藥物透皮吸收的方式增強臨床治療效果。但是本研究僅僅是細胞水平的研究，存在一定的局限性，所以下一步我們會考慮將腫瘤細胞移植到小鼠體內，建立動物模型的方式進一步對其作用機制進行探究。