女性生殖道念珠菌病病原體檢測方法探討

杜 笠，杜秋蓉，劉祥琴，姜 偉

(1.四川天府新區人民醫院檢驗醫學中心，四川 成都 610213；2.成都中醫藥大學附屬醫院檢驗科，四川 成都 610075；3.四川省醫學科學院·四川省人民醫院檢驗科，四川 成都 610072)

女性生殖道念珠菌病是念珠菌(白念珠菌和非白念珠菌)引起的女性生殖道感染性疾病[1]。研究顯示，病原菌是以白念珠菌占主要地位，其他的非白念珠菌(光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)占少數[2]。由于近年廣譜抗生素、腎上腺皮質激素、免疫抑制劑等的大量使用，發病率呈明顯上升趨勢。隨著年齡的增加，身體機能下降，導致體內菌群失衡，增加了念珠菌等病原菌感染的風險[3]。加上非處方抗真菌藥物使用，造成不規范的治療，以及環境因素等，對女性生殖道念珠菌病的診斷與治療造成不利影響[4]。因此，采取有效、準確的方法對患者的陰道分泌物進行檢驗以確定感染程度并明確診斷有利于患者的治療，對念珠菌的致病性、預防和監測具有其重要意義。本文采用直接真菌涂片鏡檢法、實時熒光PCR定性法、念珠菌顯色培養法對門診高度懷疑陰道念珠菌病就診者陰道分泌物標本640例進行檢測，并對結果進行對比分析，以尋找更好的、有利于臨床的檢驗方法，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年3月1日至2019年11月29日天府新區人民醫院、四川省人民醫院和成都中醫藥大學附屬醫院婦科門診就診的高度懷疑陰道念珠菌病的陰道分泌物標本640例，將棉拭子上的陰道分泌物標本溶解加入無菌生理鹽水的專用管，充分混勻分裝一式三份，分別用做直接真菌涂片鏡檢、實時熒光PCR定性檢測和念珠菌顯色培養。

1.2 儀器、試劑與方法

1.2.1直接真菌涂片鏡檢法 ①儀器：日本OLYMPUS雙目顯微鏡。②試劑：濃度為5%的氫氧化鈉溶液。③方法：將涂有陰道分泌物載玻片滴加濃度為5%的氫氧化鈉溶液兩滴，涂抹均勻后放在顯微鏡下進行檢查，看是否有霉菌孢子和/或菌絲，若有為陽性結果。

1.2.2實時熒光PCR定性法 ①儀器：美國ABI 7500型實時熒光PCR儀、eppendorf生產的Centrifuge 5430離心機、恒溫金屬浴、漩渦震蕩器、生物安全柜等。②試劑：廈門泰普生物科學有限公司生產的白色念珠菌、光滑假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌三種核酸檢測試劑盒。③方法：向裝有棉拭子標本的采樣容器中加入1 ml生理鹽水，充分振蕩混勻后，轉移到1.5 ml離心管中，離心12000 r/5 min，去除上清，加入600 μl已配制好的清洗液B(試劑盒中的濃縮清洗液B與滅菌注射用水按1∶9的比例配制，放置4 ℃冰箱備用)，充分震蕩混勻，離心12000 r/5 min，去除上清(此洗滌步驟重復三次)，加100 μl的DNA提取液重懸，混勻，再加入試劑盒中的提取固形物，強力振蕩至少15 min，離心10 s，將離心管放入到恒溫金屬浴中加熱裂解細胞15 min，取出，放入到-20 ℃的冰箱進行冰浴15～20 min，取出，離心12000r/2 min，取上清5 μl加入到反應體系中(反應體系按照試劑盒說明書進行配制：計算需要進行的反應管數n后，n×44.3 μl GBS-PCR混合液，n×0.5 μl Taq DNA聚合酶，n×0.2 μl UNG酶，n×1 μl內對照加入一個離心管并振蕩混勻，離心10 s后，分裝至n個PCR擴增管，每管45 μl，放4 ℃冰箱備用)，同時加白色念珠菌(CA)、光滑假絲酵母菌(CG)和熱帶假絲酵母菌(CT)的陰性及陽性對照樣品，進行擴增。編輯樣本信息并按下列循環參數進行擴增反應：Stage 1設37 ℃-2 min；Stage 2設94 ℃-2 min；Stage 3設94 ℃-2 sec，55 ℃-45 sec，循環10次；Stage 4設94 ℃-2 sec，55 ℃-45 sec(在此步收集熒光信號)，循環30次。CA/CG/CT-DNA熒光素：FAM，內參照熒光素：Texas Red。結果判讀：讀FAM熒光素Ct值=30或者“Undet.”，Texas Red熒光素Ct值<30，擴增曲線呈典型S型，為CA/CG/CT-DNA陰性結果；當CA/CG/CT-DNA的FAM熒光素Ct值≤23，擴增曲線呈典型S型，Texas Red熒光素Ct值≤30，為CA/CG/CT-DNA陽性結果。

1.2.3念珠菌顯色培養法 ①儀器：二氧化碳培養箱。②試劑：加氯霉素的沙保羅培養基、念珠菌顯色培養基。③方法：在生物安全柜中，用一次性接種環或棉簽以無菌方法取陰道分泌物標本直接劃線接種于含氯霉素的沙保羅培養基，然后置于35 ℃10%二氧化碳培養箱進行培養，2～3天觀察培養結果，若見奶油狀、表面光滑的菌落，并帶有酵母氣味為培養陽性。然后從含氯霉素的真菌(沙保羅)培養基上挑取菌落，接種于念珠菌顯色培養基，于35 ℃10%二氧化碳的真菌培養箱放置 48 小時，觀察顏色變化，若出現綠色或翠綠色菌落，則判定為CA；若出現藍灰色或鐵藍色菌落，則判定為CT；若出現白色菌落，則判定為CG或其他酵母菌。

1.3 統計學方法采用SPSS 22.0軟件分析數據。計數資料比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

640例標本經直接真菌涂片鏡檢陽性198例(陽性率30.9%)；實時熒光PCR定性結果：三種念珠菌陽性為296例(陽性率46.3%)，包括白色念珠菌(CA)234例、光滑假絲酵母菌(CG)39例、熱帶假絲酵母菌(CT)23例，其中CA合并CT共5例。念珠菌顯色培養法檢測結果：三種念珠菌陽性為287例(陽性率44.8%)，包括CA共229例、CG共36例、CT共22例，CA合并CT共3例。

三種方法陽性率比較：直接真菌涂片法低于顯色培養法和實時熒光PCR定性(χ2分別為31.66，25.30，P<0.05)，實時熒光PCR定性法與顯色培養法比較，差異無統計學意義(P>0.05)。以顯色培養法為金標準，直接真菌涂片法對生殖道念珠菌病診斷的敏感度為68.99%，特異度為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為79.64%，約登指數為0.69。實時熒光PCR定性法對生殖道念珠菌病診斷的敏感度為100%，特異度為97.45%，陽性預測值為96.96%，陰性預測值為100%，約登指數為0.97。見表1。

表1 直接真菌涂片鏡檢法、實時熒光PCR定性法和念珠菌顯色培養法檢測結果

3 討論

有70%的正常健康女性生殖道內存在著念珠菌[5]，其感染已成為引起女性生殖道疾病的第二大病因，其發病率僅次于細菌性陰道炎[1，6]，多數研究顯示，任何破壞陰道局部環境穩定的因素，都可能導致念珠菌陰道病的發生[7]。念珠菌陰道病作為臨床婦科的常見病，且常有比較高的復發率[1，8，9]，該病的癥狀主要是：外陰瘙癢，嚴重時坐臥不寧，非常痛苦，尤其是對反復發作的患者，常常承受著巨大的身心健康方面的壓力。因此，快速、準確的檢測結果對診斷和治療該病十分重要。

本研究結果顯示，涂片鏡檢法為陰性的標本，用熒光PCR定性方法檢測，結果為陽性，這種結果存在的原因：一是直接真菌涂片鏡檢靈敏度低；二是人為因素，在門診大量標本的壓力下，觀察視野不足；三是涂片標本太少；四是一些慢性或者經過治療的患者，本身含菌量就少，鏡檢不易發現。同時，涂片鏡檢法為陽性的8份標本，而熒光PCR定性方法檢測為陰性，這種情況可能是由于該8份標本所感染的類型并非CA、CG、CT這三種念珠菌，故直接真菌涂片鏡檢法和熒光PCR定性法檢測結果不一致。

另外，有5例標本熒光PCR定性法檢測為CA合并CT感染，經念珠菌顯色培養法檢出3例CA合并CT感染，其余為單一念珠菌感染。經分析，兩種方法檢測結果出現差異的原因如下：①熒光PCR定性方法本身的局限是病原體死亡后的核酸仍能通過PCR擴增檢測到，但無法判定是否死菌還是活菌，從而得到兩種不同念珠菌陽性的結果。②用念珠菌顯色培養法檢測標本，標本中劣勢菌菌量少，被優勢菌抑制，導致只分離到一種念珠菌陽性的結果。

本文對采用直接真菌涂片鏡檢法、實時熒光PCR定性法、念珠菌顯色培養法三種方法檢測陰道分泌物的結果進行了對比分析，從結果來看，直接真菌涂片鏡檢法操作簡便、費用低廉，報告及時，但靈敏度低，易造成漏檢，尤其不適合慢性及治療過程的患者，同時不能區分念珠菌的種類。真菌培養法(顯色法)靈敏度和特異度高，其鑒定和藥敏試驗結果對臨床針對性用藥有著重要的指導意義，但操作繁瑣，需要培養2～3天，不能為臨床提供早期診斷和治療的依據。當實驗室的環境條件、培養箱CO2濃度及濕度、溫度等不能保證時，培養結果會產生較大誤差[10]。熒光PCR定性法具有操作方便、快速、靈敏和特異強等優點，同時可以進行真菌分類，在具有核酸檢測平臺的實驗室應推廣應用，雖然熒光PCR定性法還未覆蓋所有念珠菌，但目前包含了三種最常見的念珠菌，從本次探索中發現與大家公認的培養法比較，具有高度一致性。

綜上所述，應綜合患者及醫院實際情況來選用合適的檢測法。最好在具有核酸檢測條件的實驗室首推熒光PCR定性法來檢測CA、CG、CT，為臨床提供及時的病原學診斷和治療依據。