牙周抗菌肽緩釋水凝膠的構建與性能研究

彭湃然，任 靜，黃 杰，牟雁東，2

(1.西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院口腔科，四川 成都 610031)

牙周炎是由牙齦下微生物引起的慢性感染性炎癥，其不僅會持續(xù)性破壞牙齒支撐組織，導致附著喪失和牙齒脫落，還與全身性疾病如心血管疾病、類風濕性關節(jié)炎和肥胖癥存在關聯[1]。臨床上應對牙周炎的核心手段是以機械方法去除牙菌斑的牙周基礎治療，通過牙周潔治、齦下刮治和根面平整術(SRP)能去除牙周袋內大部分菌斑[2]。但對于已經產生深牙周袋的病例，單純的機械性潔治無法取得良好的療效，需要局部使用藥物作為輔助治療[3]。本實驗構建了一種裝載抗菌肽DP7的牙周袋內注射用緩釋水凝膠，并檢測其溫敏性、緩釋性和穩(wěn)定性。同時通過大鼠牙周炎動物模型，檢測牙周抗菌肽緩釋水凝膠注射后的毒性及治療效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究于2019年6～12月在四川大學生物治療國家重點實驗室及四川省人民醫(yī)院動物實驗中心完成。抗菌肽DP7由四川大學生物治療國家重點實驗室提供，大鼠由成都達碩實驗動物公司提供。選用8周齡SPF級雄性SD大鼠40只用于體內實驗，體重180～220 g，大鼠雙側上頜磨牙及牙周組織均正常。于四川省人民醫(yī)院動物實驗中心在恒溫25 ℃，濕度55%環(huán)境下以標準實驗大鼠飼料和自來水喂養(yǎng)。將40只大鼠用隨機數字表法均分為牙周抗菌肽緩釋水凝膠組(A組)、空白凝膠組(B組)、派麗奧組(C組)、自然愈合組(D組)各10只，將每組10只大鼠再用隨機表法分為2組，分別用于毒性評價和療效評價。

1.2 方法

1.2.1牙周抗菌肽緩釋水凝膠的構建 冷溶法構建水凝膠定量稱取泊洛沙姆188和泊洛沙姆407，溶于適量超純水，4 ℃恒溫水浴攪拌均勻后于4 ℃冰箱冷藏24 h得到膠體待用。于膠體中加入抗菌肽DP7(1%，wt%)，4 ℃恒溫水浴攪拌均勻，4 ℃冷藏24 h，即獲得濃度1%的牙周抗菌肽緩釋水凝膠。

1.2.2牙周抗菌肽緩釋水凝膠的性能評價 ①膠凝溫度(Tsol-gel)的測定：取1 ml抗菌肽DP7緩釋水凝膠，置于直徑為1 cm的薄壁試管中，在20 ℃水浴鍋內以1 ℃每分鐘的速度升高水溫，溫度每升高0.5 ℃，將試管倒置，30秒后不發(fā)生流動即為膠凝，記錄此時溫度。②膠凝時間(tsol-gel)的測定：取1 ml抗菌肽DP7緩釋水凝膠，放入西林瓶中，4 ℃平衡10 min后傾斜西林瓶并于37 ℃恒溫水浴，待彎月面凝膠不流動時，記錄此時時間。以上實驗重復3次。③體外釋放實驗將抗菌肽DP710 mg與超純水40 ml配制成2 mg/ml溶液，空白對照組為超純水，采用紫外-可見分光光度法在 200～800 nm 波長范圍內進行掃描，觀察抗菌肽的最大吸收波長。梯度稀釋法配置1000、500、200、100、50、20 μg/ml的抗菌肽溶液。用高效液相色譜法(HPLC)測定吸收峰面積積分值，繪制抗菌肽標準曲線。在37 ℃恒溫環(huán)境下取1 ml牙周抗菌肽緩釋水凝膠，加入PBS(pH=7.4)5 ml，于2、4、8、12、24、48、96、168 h時間點各取樣500 μl，同時加入PBS 500 μl。樣本離心后(10000 r/min，3 min)，用HPLC檢測，計算藥物釋放量，繪制藥物體外釋放曲線。④穩(wěn)定性實驗將牙周抗菌肽緩釋水凝膠放置于4 ℃冰箱中保存，分別于0、6、12、24、48、72 h后取樣1 ml，加入PBS(pH=7.4)5 ml，藥物完全釋放后用HPLC檢測。

1.2.3牙周抗菌肽緩釋水凝膠的毒性評價 實驗中，大鼠腹腔注射7%水合氯醛(0.5 ml/100 g)麻醉后，分別給予A、B、C組牙周袋內注射1%牙周抗菌肽水凝膠、空白水凝膠、派麗奧軟膏，至藥物溢出牙周袋，給藥方式為每周給藥1次。D組不做處理，給藥4周后處死，取心、肝、脾、肺、腎器官，于4%甲醛固定，梯度脫水，浸蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后觀察各臟器是否發(fā)生毒理學改變。

1.2.3牙周抗菌肽緩釋水凝膠的療效評價 實驗大鼠麻醉后以右側第一磨牙為建模牙，用雙線法輔以高糖飲食建立牙周炎模型，具體操作為：將0#醫(yī)用縫線埋入齦溝內，再用0.20 mm正畸結扎絲結扎牙頸部。期間所有大鼠喂養(yǎng)高糖飼料，定期檢查，及時重新結扎松動、脫落的結扎絲。8周后，大鼠牙周炎形成，停止喂養(yǎng)高糖飲食。麻醉大鼠，去除結扎絲及縫線，對A、B、C組牙周潔治后分別使用1%牙周抗菌肽水凝膠、空白水凝膠、派麗奧軟膏，給藥方式為牙周袋內注射至藥物溢出牙周袋，頻率為每周1次。D組僅行牙周潔治。給藥第0、2、4周后分別麻醉大鼠，觀察牙齦狀態(tài)，探診牙周袋深度。

1.3 統計學方法采用SPSS 26.0統計軟件進行數據處理分析。定量數據采用均數±標準差表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠凝條件測定結果溶液在高于一定溫度條件下形成凝膠，測得最小膠凝溫度為(25.80±0.45)℃。在模擬體溫的37 ℃條件下，膠凝時間為(15.40±0.89)秒。

2.2 體外釋放實驗結果紫外分光光度計檢測最大吸收波長為220 nm。以抗菌肽濃度為X軸，峰面積為Y軸，繪制標準曲線方程：Y=14366X+564635，r=0.9987。抗菌肽標準曲線見圖1。牙周抗菌肽緩釋水凝膠的體外藥物釋放曲線，在最初的48 h內藥物釋放較快，隨后持續(xù)減慢，可持續(xù)釋放長達7天，見圖2。

圖1 抗菌肽標準曲線

圖2 體外釋放曲線

2.3 穩(wěn)定性實驗6個時間點樣品吸收峰面積為(1063754.83±20093.97)，RSD值為1.89%(n=6)，顯示牙周抗菌肽緩釋水凝膠在低溫(4 ℃)環(huán)境下，72 h內維持穩(wěn)定。

2.4 毒性及療效評價

2.4.1毒理學檢測結果 鏡下觀察各組大鼠臟器病理切片，未見心肌纖維橫紋紊亂及細胞不良分化；肝小葉、肝素、肝竇結構清晰，肝細胞形態(tài)正常；腎小球、腎小管形態(tài)正常，腎皮質髓質分界清晰，間質無出血或炎癥；未見脾水腫，淋巴小結清晰；肺泡均勻擴張，無水腫，未見炎性浸潤區(qū)。見圖3。

圖3 各組臟器組織切片 a-e、f-j、k-o、p-t依次為A、B、C、D組大鼠心、肝、脾、肺、腎組織(HE，×100)

2.4.2治療效果評價 0周時各組牙齦狀態(tài)無差異(P>0.05)。用藥2周后，A、C組牙齦紅腫程度略輕，探診深度下降(P<0.01)；4周后，與B、D兩組相比，A組牙齦炎癥明顯消退，探診深度降低顯著(P<0.01)。C組也可見牙齦紅腫減輕，探診深度低于0.2周(P<0.01)。牙周袋探診結果見表1。

表1 四組牙周袋探診深度比較 (mm)

3 討論

口腔是人體中菌群種類、數量最多的部位之一，有超過770種細菌存在于口腔中[4]，牙齦下微生物形成的生物膜與易感宿主之間的體內平衡喪失導致了牙周炎的發(fā)生。牙周炎造成的牙周組織損害主要來源于過度的宿主-病原炎性反應。在牙周局部組織中，牙齦卟啉單胞菌等牙周致病菌激活宿主自身免疫應答，大量產生白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性因子，引發(fā)強烈的炎癥反應[5，6]。而目前對于耐藥菌產生的牙周炎，缺乏有效的局部用藥。因此開發(fā)一種具備良好消炎抑菌效果的緩釋藥物用于輔助牙周基礎治療，具有重大的臨床意義。

目前局部給藥體系主要包括膜劑、微球、水凝膠等[7]。水凝膠作為一種新型緩釋給藥載體，它與人體組織結構具有相似性，能以液態(tài)給藥，隨后在用藥部位發(fā)生相轉變，由液態(tài)轉變?yōu)槟z態(tài)，同時具有組織兼容性佳、緩釋效果良好、制備工藝簡單等優(yōu)勢而備受關注[8]。為了更好地控制凝膠的相轉變，受到外界特定刺激后發(fā)生膠凝的智能水凝膠逐漸成為研究熱點，目前報道了包括溫度敏感型、光敏感型、pH敏感型、生化分子敏感型等多種智能水凝膠[9～11]。其中，溫敏型水凝膠受到體溫刺激快速響應發(fā)生膠凝的特性讓它成為一種良好的口腔藥物載體，具有給藥方便、提高局部藥物濃度、降低藥物毒副作用，延長藥物在體內的作用時間等優(yōu)點，具有很好的臨床應用前景[12，13]。本實驗運用泊洛沙姆188、407作為凝膠基質制備的牙周抗菌肽緩釋水凝膠具有溫敏特性，在體溫下膠凝時間僅為15.4秒，能以溶液形態(tài)被注射入牙周袋內，并迅速轉變成凝膠態(tài)粘附于牙齦上，操作簡單便捷，易于臨床推廣運用。而長達7天的緩釋能力使得抗菌肽注射入牙周袋后能夠長時間維持，從而起到減少藥物用量及給藥頻次，提高藥物生物利用度的效果。

抗菌肽是一類由生物體產生的具有抗菌活性的物質，它們可以抵抗病毒、細菌、真菌、寄生蟲、腫瘤細胞等多種因素引起的感染，是生物先天免疫系統的關鍵部分之一，目前發(fā)現并報道的天然抗菌肽超過2900種[14，15]。因濫用抗生素導致耐藥菌的增加，嚴重威脅了公眾的健康[16]，而抗菌肽的廣譜抗菌活性和對多重耐藥細菌的有效殺菌作用已得到廣泛認可[17]。新型陽離子抗菌肽DP7來源于牛中性粒細胞中的抗菌肽HH2，具有良好的體內外抗菌活性和免疫調節(jié)能，在體外和體內實驗中都表現出高抗菌活性和低溶血性的特點[18，19]。體外實驗還發(fā)現大鼠骨髓間充質干細胞受到特定濃度的DP7刺激后，成骨性分化能力增強，ALP活性及鈣沉積能力增加[20]。本實驗以抗菌肽DP7作為主藥治療大鼠牙周炎4周后，發(fā)現大鼠牙齦紅腫、牙周袋等臨床癥狀明顯緩解，這可能與DP7對厭氧菌的抑制作用有關。本實驗構建的牙周抗菌肽緩釋水凝膠有望作為輔助藥物用于牙周炎臨床治療。