IDH1 R132H 突變對不同級別膠質(zhì)瘤的影響及相關因素分析

杜 寧 王新軍 楊 卓 曾凡濤

鄭州大學第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052

膠質(zhì)瘤是來源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腫瘤，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。目前膠質(zhì)瘤的治療是以手術為主輔以術后放化療的綜合治療方式，但因其具有高侵襲性、易復發(fā)、易升級等特點，其治療效果一直差強人意［3］。近年來隨著分子生物學的發(fā)展，與膠質(zhì)瘤相關的基因異常被人們揭示，基于分子水平的靶向治療、免疫治療等成為膠質(zhì)瘤治療新的思路和方向。異檸檬酸脫氫酶-1（isocitrate dehydrogenase，IDH1）在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演者舉足輕重的角色。2008 年，PARSONS 等［4］在膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）的基因組測序研究中首次發(fā)現(xiàn)IDH1突變。隨后進一步研究［5-6］顯示，80%～90%的Ⅱ級、Ⅲ級膠質(zhì)瘤中存在IDH1突變，而原發(fā)膠質(zhì)母細胞瘤中這一突變則少見。此外，IDH有IDH1、IDH2 和IDH3 三種同工酶，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中IDH1 突變最為常見，其突變頻率遠高于其他兩種同工酶［7］。IDH1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中最常見突變位點是第132位精氨酸殘基，80%～90%的突變類型是R132H［8］。IDH1在膠質(zhì)瘤中起著重要作用，但其影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的機制尚不清楚，以此為靶點的靶向治療的療效尚不明確，均有待進一步研究。

本文旨在進一步研究IDH1 在膠質(zhì)瘤組織及細胞系中的表達，探索IDH1在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為膠質(zhì)瘤的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料購買U87、U251、LN-229、HS683、U118 膠質(zhì)瘤細胞系，傳代培養(yǎng)后用備用。回顧性收集2014-06—2019-06 于鄭州大學第五附屬醫(yī)院行手術治療并經(jīng)病理證實為膠質(zhì)瘤的76例患者。納入標準：①影像學檢查+術后病理證實明確為Ⅱ級及以上膠質(zhì)瘤；②原發(fā)腫瘤并首次接受手術治療；③既往無其他顱內(nèi)疾病史，如腦炎、顱內(nèi)感染等。排除標準：①患者臨床信息不完整；②患者及家屬拒絕提供標本及臨床信息用于本研究；③經(jīng)病理證實為WHOⅠ級膠質(zhì)瘤。76例患者中，5例因臨床信息及隨訪信息不完整排除，1 例因患者及家屬拒絕參與研究排除，剩余70 例患者，男39 例，女31 例；年齡（49.47±13.3）歲；WHO 分級：Ⅱ級29 例，Ⅲ級24 例，Ⅳ級17例；病理證實星形膠質(zhì)細胞瘤30例，少突膠質(zhì)細胞瘤21 例，星形少突膠質(zhì)細胞瘤4 例，膠質(zhì)母細胞瘤15例。本研究獲得患者家屬及倫理委員會同意。

1.2 主要試劑與儀器mIDH1 R132H 單克隆抗體型號1L-226購自日本株式會社免疫生物研究所；二抗反應增強液型號PV-9000、二抗增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG 聚合物及DAB 顯色液型號ZLI-9019 購自北京中杉金橋生物技術有限公司；DYY-6C型雙穩(wěn)定時電泳儀購自北京六一儀器廠，熒光顯微鏡購自日 本Nikon 公 司；RNA 提 取 液 型 號G3013，購 自Servicebio 公司；臺式高速冷凍型微量離心機型號D3024R，產(chǎn)自DragonLab 公司；熒光定量PCR 儀型號Stepone plus，產(chǎn)自ABI公司；超微量分光光度計型號NanoDrop2000，產(chǎn)自Thermo公司。

1.3 q-PCR 分析不同膠質(zhì)瘤細胞系中IDH1 的表達RNA 提取：微量移液器將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸除干凈，加入1 mL 4 ℃預冷的PBS溶液，輕搖洗滌，用微量移液器將PBS吸除干凈，加入1 mL的RNA提取液，用槍頭吹打，破碎細胞。將液體轉(zhuǎn)移到滅過菌的1.5 mL離心管內(nèi)并加入250 μL三氯甲烷，充分混勻，靜置3 min，離心，將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入異丙醇混勻，4 ℃下離心，取RNA 沉淀。75%乙醇洗滌，再次離心后去除上清液，溶解RNA，55 ℃孵育5 min。檢測RNA 濃度及純度，確保使其終濃度為100～500 ng/μL（IDH1-S：5'-GCATAGGCTCATCGA CGACAT-3'；IDH1-A：5'-CAGCCTCTGCTTCTACTG TCTTGC-3'）。最后進行反轉(zhuǎn)錄操作，定量PCR按照合適比例配置反應體系進行PCR 擴增。用CT 值對比分析不同細胞系中IDH1的表達情況。

1.4 免疫組化法檢測IDH1 R132H突變表達情況以及Ki-67的表達將標本包埋、制片，然后添加一抗、二抗，DAB顯色液鏡下顯色觀察；蘇木素復染、清水返藍后中性樹膠封片，鏡下觀察，以PBS緩沖液代替一抗作對照。根據(jù)細胞內(nèi)染色情況來判斷IDH1 R132H 突變表達情況，光鏡下可見膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)因IDH1 R132H表達不同而呈現(xiàn)深淺不一的棕褐色，取得免疫組化圖片后，采用Image-Pro Plus6.0軟件對膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)染色以平均光密度值的形式進行量化，以此間接的、半定量的表示IDH1 R132H表達情況。

1.5 WB法檢測IDH1 R132H突變表達情況取冰凍標本進行蛋白裂解，制備分離膠、濃縮膠，按照電泳、轉(zhuǎn)膜、加一抗、孵育、過夜、加二抗、孵育、顯色、曝光等步驟，得到蛋白條帶。用Image J 軟件對蛋白條帶進行量化，將腦膠質(zhì)瘤標本蛋白條帶的D 值與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的D值進行相比，所得值代表蛋白表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 24.0進行統(tǒng)計學處理，所得數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，采用兩獨立樣本t檢驗；多樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK法或K-W檢驗，分類變量采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 膠質(zhì)瘤相關細胞系中IDH1 的表達q-PCR 法檢測U87、U251、LN-229、HS683、U118等5種膠質(zhì)瘤細胞系中IDH1 的表達，HS683、U87 膠質(zhì)細胞系中IDH1表達明顯高于其他膠質(zhì)瘤細胞系。見圖1。

圖1 不同膠質(zhì)瘤細胞系中IDH1的表達量（U87、HS683的相對表達量均＞50%）Figure 1 Expression of IDH1 in different glioma cell lines（The relative expression levels of U87 and HS683 both exceeded 50%）

2.2 人腦膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H 的表達70例人腦膠質(zhì)瘤組織通過免疫組化法和WB 法檢測IDH1 R132H表達（圖2～3），結果顯示，IDH1 R132H突變36例，突變率51.4%，20例對照組腦組織標本中IDH1 R132H 突變0 例。膠質(zhì)瘤組織中WHO 分級Ⅱ級29 例，突變15 例，突變率51.7%；Ⅲ級24 例，突變19 例，突變率79.2%；Ⅳ級17 例，突變2 例，突變率11.8%；不同病理級別IDH1 R132H 突變差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。70 例膠質(zhì)瘤組織中星形膠質(zhì)細胞瘤30 例，突變24 例，突變率80.0%；少突膠質(zhì)細胞瘤21 例，突變11 例，突變率52.4%；星形少突膠質(zhì)細胞瘤4 例，突變0 例；膠質(zhì)母細胞瘤15 例，突變1 例，突變率6.7%；不同病理類型IDH1 R132H 突變差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 IDH1 R132H突變與腦膠質(zhì)瘤患者臨床因素的關系70 例膠質(zhì)瘤患者年齡（49.47±13.3）歲，IDH1野生型患者年齡（53.7±12.3）歲，IDH1突變型患者年齡（45.4±13.7）歲，兩者對比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.008）。此外IDH1 突變與患者病理級別（P＜0.001）、病理類型（P＜0.001）、是否并發(fā)癲癇（P=0.034）以及Ki-67（P=0.03）的表達有關，與患者性別、腫瘤大小、腫瘤位置無關（P＞0.05）。見表1。

表1 IDH1 R132H 突變與腦膠質(zhì)瘤患者臨床因素的關系Table 1 Relationship between IDH1 R132H mutation and clinical factors in patients with glioma

2.4 IDH1 R132H突變與臨床預后的關系Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1 R132H型預后好于IDH1野生型（P＜0.05），Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1突變型和野生型患者生存期差異無統(tǒng)計學意義（P=0.72）。總生存期（OS）生存分析見圖4。

3 討論

圖2 免疫組化法檢測人腦膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H的表達 A：陰性對照以及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H的表達免疫組化圖片（400×）；B：星形、少突、星形少突膠質(zhì)瘤以及膠質(zhì)母細胞瘤組織中IDH1 R132H 的表達免疫組化圖片（400×）；C：Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H表達與陰性對照組及Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；D：星形膠質(zhì)細胞瘤組織中IDH1 R132H表達與陰性對照組（P＜0.001）及其他類型膠質(zhì)細胞瘤中IDH1 R132H表達差異有統(tǒng)計學意義（*P＜0.001）Figure 2 Expression of IDH1 R132H in human glioma was detected by immunohistochemistry. A：Negative control andⅡ，Ⅲ，Ⅳgrade glioma tissues IDH1 R132H immunohistochemical expression images（400×）； B：Immunohistochemical images of IDH1R132H expression in anaplastic astrocytoma， oligodendroglioma， anaplastic oligodendroglioma， and glioblastoma （400×）； C：Ⅱ，Ⅲgrade glioma tissues IDH1 R132H expression and the negative control group and Ⅳgrade glioma group in IDH1 R132H expression difference was statistically significant （P＜0.001）； D：The expression of IDH1 R132H in anaplastic astrocytoma was significantly different from that in the negative control group （P＜0.001） and other types of glioma （*P＜0.001）

2007 年世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）腫瘤分類按組織學形態(tài)將膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級，并認為Ⅰ級為良性，Ⅱ級為交界性，Ⅲ級為惡性，Ⅳ級為高度惡性［9］。隨后IDH1突變被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤的演變中發(fā)揮重要作用，并影響著膠質(zhì)瘤的預后。2016 年WHO 對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的新分類將IDH1 突變型與野生型作為參考因素納入到膠質(zhì)瘤的分類中［10］。IDH 是三羧酸循環(huán)中的關鍵限速酶，催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸（α-KG）及二氧化碳，可為細胞新陳代謝提供能量和生物合成前體物質(zhì)，在生命活動中發(fā)揮重要作用［11］。IDH 也參與調(diào)節(jié)多種細胞內(nèi)過程，包括氧化呼吸、谷氨酰胺代謝、脂肪生成和細胞防御氧化損傷等［12］。目前普遍認為IDH1 突變是導致膠質(zhì)瘤發(fā)生的重要影響因素之一，且多項研究［13-14］顯示，相同病理級別膠質(zhì)瘤患者IDH1突變型預后較IDH1野生型要好，但IDH1突變導致膠質(zhì)瘤發(fā)生的機制仍有待研究，目前主流觀點認為IDH1突變可導致DNA和組蛋白的異常高甲基化從而導致腫瘤的發(fā)生［15］。IDHl 突變也可導致2-HG 異常增高，2-HG 是一種腫瘤細胞代謝產(chǎn)物，可能在惡性腦腫瘤的發(fā)生中起重要作用［16］。

圖3 WB檢測人腦膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H的表達情況 A：陰性對照以及Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H的表達蛋白條帶；B：不同病理級別膠質(zhì)瘤組織中IDH1 R132H表達情況，與control組比較，*P＜0.05；與grade Ⅳ比較，#P＜0.05Figure 3 WB was used to detect the expression of IDH1 R132H in human glioma tissues.A：Negative control and Ⅱ，Ⅲ，Ⅳgrade glioma tissues IDH1 R132H expression of the protein bands；B：Different pathological grade glioma tissues IDH1 R132H expression，compared with the control group，*P＜0.05；and compared with grade Ⅳ，#P＜0.05

圖4 相同病理級別下IDH1 突變型與野生型生存分析 A：Ⅱ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1 突變型較IDH1 野生型預后好（P＜0.05）；B：Ⅲ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1突變型較IDH1野生型預后好（P＜0.05）；C：Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1突變型較IDH1野生型預后差異無統(tǒng)計學意義（P=0.72）Figure 4 Survival analysis of IDH1 mutant and wild-type at the same pathological level. A：Ⅱgrade glioma IDH1 mutations in patients with good prognosis than IDH1 wild type（P＜0.05）；B：Ⅲgrade glioma IDH1 mutations in patients with good prognosis than IDH1 wild type （P＜0.05）； C：Ⅳgrade glioma in patients with glioma IDH1 wild type and mutant IDH1 prognosis compared to no significant statistical difference（P=0.72）

本研究進一步探討IDH1突變與膠質(zhì)瘤的關系，結果顯示q-PCR法檢測U87、U251、LN-229、HS683、U118 等5 種膠質(zhì)瘤細胞系中IDH1 的表達，HS683、U87膠質(zhì)細胞系中IDH1表達明顯高于其他膠質(zhì)瘤細胞系。考慮原因為不同膠質(zhì)瘤細胞系來源于不同級別及不同類型的膠質(zhì)瘤組織，因此細胞系之間IDH1表達存在差異，IDH1表達高者，突變率也相對較高，這也解釋了IDH1 突變在不同膠質(zhì)瘤中存在差異。此外，由于IDH1 突變型膠質(zhì)瘤很難在體外培養(yǎng)，因此很多相關研究難以開展，故本研究提示HS683、U87 膠質(zhì)細胞系可作為細胞實驗及體外試驗的研究對象，容易構建突變模型，提高實驗成功率。組織學實驗發(fā)現(xiàn)，人腦膠質(zhì)瘤組織中IDH1 的突變率為51.4%，且突變多發(fā)生在Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤中，考慮到本研究僅檢測了IDH1 R132H一種突變，總體突變率偏低，但基本與國內(nèi)外研究相符。此外本研究還顯示，IDH1 R132H突變常見于星形膠質(zhì)細胞瘤，突變率高達80%，少突膠質(zhì)細胞瘤突變率為52.4%，而膠質(zhì)母細胞瘤突變率則僅有6.7%。已有研究［17］報道IDH1 R132H多見于彌漫星形膠質(zhì)細胞瘤和間變星形膠質(zhì)細胞瘤。另有研究［18］顯示IDH1 突變與膠質(zhì)瘤患者并發(fā)癲癇具有一定的相關性，本研究再次證實了這一研究結果，IDH1 R132H突變與膠質(zhì)瘤并發(fā)癲癇確實存在顯著差異。

Ki-67是一種相對分子量為36 000的核抗原，與細胞周期關系密切［19］。Ki-67 在正常腦組織中不表達，卻在腦膠質(zhì)瘤中異常高表達［20-22］。本研究顯示，IDH1 R132H 突變者Ki-67 表達較IDH1 野生型低，IDH1 R132H突變與Ki-67異常表達差異有統(tǒng)計學意義。本研究生存分析顯示，在Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤患者中IDH1 R132H突變者生存期更長，預后明顯優(yōu)于IDH1野生型。在Ⅳ級膠質(zhì)瘤患者中，IDH1 R132H突變者與IDH1野生型預后在統(tǒng)計學上無明顯差異。研究顯示IDH1野生型的Ⅱ、Ⅲ級膠質(zhì)瘤比相同病理級別的IDH1 突變型膠質(zhì)瘤的預后差［23-25］。此外，亦有研究顯示IDH1 突變患者對替莫唑胺的敏感度更高［26-28］，使用IDH1 R132H 特異性肽的疫苗可引起特異性的抗腫瘤反應，對抗IDH1 R132H 表達的腫瘤細胞，減少顱內(nèi)腫瘤的生長［29-31］。

本研究再次證實了IDH1 R132H 是影響膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素，可作為判斷膠質(zhì)瘤患者預后的重要標志，實驗證實HS683、U87 膠質(zhì)細胞系可作為研究對象，進一步行膠質(zhì)瘤分子生物學研究，IDH1 R132H 影響膠質(zhì)瘤的作用機制仍需進一步研究。