FAM134B 介導的內質網自噬在無鎂外液致癇海馬神經元線粒體鈣穩態及凋亡中的作用

李鈺娟 王 翠 杜麗媛 孟祥荷 劉鳳霞 謝南昌

鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州450052

內質網是蛋白質折疊、轉運、加工和儲存鈣離子的重要細胞器［1］。細胞應激條件下，內質網通過自噬在維持細胞內穩態中發揮重要作用［2］。內質網自噬是一種選擇性的內質網降解形式，通過內質網自噬受體吞噬內質網片段傳遞到自噬體中進行溶酶體降解，維持內質網形態及功能穩態［3］。FAM134B（family with sequence similarity 134，member B）是哺乳動物細胞中發現的第一個也是迄今為止最具特征的內質網自噬受體，其包含的LC3 相互作用區域（LC3-interacting regions，LIR）可誘導內質網片段化，在內質網容量和質量控制中起關鍵作用［4-5］。

線粒體Ca2+攝取對線粒體代謝和內質網穩態的調節至關重要［8］。當線粒體攝取大量Ca2+發生鈣超載時，線粒體凋亡途徑將被激活引起細胞死亡［9］。因此，嚴格控制內質網和線粒體之間的Ca2+交換對細胞發揮生理功能和代謝穩態十分重要。線粒體-內質網結構偶聯（mitochondria-associated ER membranes，MAMs）是內質網與線粒體之間存在重要連接，可通過其中包含的鈣離子轉運相關蛋白，如1，4，5-三磷酸肌醇受體（inositol-1，4，5-triphosphate receptor，IP3R）等調節鈣信號傳導［6-7］。最新研究發現，FAM134B介導的內質網自噬在內質網穩態中發揮重要調節作用［5，10］。然而，FAM134B介導的內質網自噬是否可通過調節MAMs 調控內質網與線粒體之間Ca2+交換及線粒體凋亡途徑尚不清楚。

本研究通過體外培養海馬神經元，使用無鎂外液構建癲癇模型，利用慢病毒干預FAM134B 表達，研究FAM134B 介導的內質網自噬對致癇海馬神經MAMs及線粒體功能的影響，探討其在體外癲癇神經元模型的線粒體鈣離子穩態及凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料試劑：無鎂外液（2 mmol/L CaCl2，145 mmol/L NaCl，0.002 mmol/L 甘氨酸，10 mmol/L 葡萄糖，2.5 mmol/L KCl 和10 mmol/L HEPES，pH 7.4）；正常細胞外液（1 mmol/L MgCl2和無鎂外液各成分）；慢病毒Lenti-FAM134B、Lenti-FAM134B-shRNA和LentipGV（上海吉凱基因公司）；TUNEL試劑盒（德國Roche公司）；NSE抗體（武漢博士德生物公司）；內質網鈣離子熒光探針Mag-Fluo-AM 試劑盒（上海杰美公司）；鈣離子熒光探針Rhod-2試劑盒（上海哈靈公司）；βactin、LC3B、Cox-Ⅳ、IP3R抗體（美國CST公司）；CytC 抗體（美國Santa Cruz 公司）；cleaved caspase-3（英國Abcam）。動物：出生24 h內Sprague-Dawley 大鼠［鄭州大學實驗動物中心提供，許可證號SCXK（豫）2010-0002］。

1.2 海馬神經元原代培養手術器械高壓高溫滅菌，將SD大鼠置于超凈臺，75%乙醇浸泡后分離出大鼠海馬神經元去除表面血管膜。經胰酶消化海馬組織后制成細胞懸液，將神經元提前使用左旋多聚賴氨酸包被好于培養板中。種板4 h 后將更換培養基為維持培養基，并定期半量更換培養基1次。培養至第7天鑒定神經元純度＞90%待用。

1.3 慢病毒轉染取培養5 d的原代海馬神經元，分組后按照感染復數MOI=15 分別轉染慢病毒Lenti-FAM134B、空載病毒Lenti-pGV 或Lenti-FAM134BshRNA。感染12 h后用維持培養基換液，繼續培養3 d于熒光顯微鏡下觀察熒光行后續試驗。

1.4 實驗分組將原代海馬神經元分5 組：對照組（CON 組）、無鎂誘導組（AE 組）、空載病毒組（NC組）、Lenti-FAM134B 組（FAM134B 過表達組）和Lenti-FAM134B-shRNA 組（FAM134B 低表達組）。培養至第10天，CON組用正常細胞外液處理3 h，AE組用無鎂外液處理3 h 誘導癲癇模型，NC 組、FAM134B 過表達組和FAM134B 低表達組分別轉染相應慢病毒，繼續用維持培養基培養至第10天經3 h無鎂外液處理誘導癲癇模型，然后各組神經元用維持培養基繼續培養24 h。

1.5 TUNEL 染色法分別取各組細胞將其接種到爬片上，使用4%多聚甲醛固定，PBS 浸洗后，再使用0.1%TritonX-100 處理。將含神經元的細胞爬片加入TUNEL 反應液后置于濕盒中孵育，經DAPI 復染后，在熒光顯微鏡下觀察。

1.6 內質網鈣離子濃度測定各組繼續用維持培養基培養24 h 后，使用熒光探針Mag-Fluo-AM 測定內質網鈣離子濃度。各組神經元按照內質網鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產品說明書操作，使用熒光顯微鏡測定各組神經元內質網鈣離子濃度。

1.7 線粒體鈣離子濃度測定各組繼續用維持培養基培養24 h后，使用熒光探針Rhod-2測定線粒體鈣離子濃度。各組神經元按照線粒體鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產品說明書操作，使用熒光顯微鏡測定各組神經元線粒體鈣離子濃度。

1.8 觀察細胞形態去除培養基后將神經元收集至離心管中，加入戊二醛固定2 h，使用系列濃度乙醇脫水。包埋切片后使用醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察神經元線粒體超微結構。

1.9 Western blotting 檢測不同蛋白的表達分別提取全蛋白、胞質蛋白和線粒體蛋白并測量提取蛋白濃度。采用SDS-PAGE 凝膠電泳后轉膜并封閉，在4 ℃用一抗β-actin（1∶2 000）、Cox-Ⅳ（1∶2 000）、LC3B（1∶1 000）、IP3R（1∶1 000）、CytC（1∶1 000）和cleaved caspase-3（1∶300）孵育過夜。次日洗膜后加入二抗于搖床上室溫孵育1 h。洗膜后使用ECL 發光液顯像。蛋白條帶使用Image J軟件分析。

1.10 統計學處理應用SPSS 19.0 軟件處理數據，實驗數據以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒轉染后FAM134B 蛋白的表達變化AE 組 中FAM134B 表 達 高 于CON 組（P＜0.05），FAM134B 過表達組FAM134B 表達顯著高于AE 組，FAM134B 低表達組FAM134B 表達顯著低于AE 組（P＜0.05），NC組與AE組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 各組海馬神經元FAM134B蛋白表達水平Figure 1 Expression of FAM134B in hippocampal neurons of different groups

2.2 神經元凋亡檢測FAM134B 過表達組中神經元凋亡較AE組顯著減少，FAM134B低表達組神經元凋亡較AE 組顯著增加（P＜0.05），NC 組與AE 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 TUNEL法檢測細胞凋亡Figure 2 Neuronal apoptosis was detected using a TUNEL assay

2.3 各組神經元LC3-Ⅱ/Ⅰ和IP3R 表達水平AE組 中LC3-Ⅱ/Ⅰ較CON 組 顯 著 升 高（P＜0.05），FAM134B 過表達組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值較AE 組顯著升高，FAM134B 低表達組較AE 組顯著降低（P＜0.05），NC 組與AE 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3A。與CON 組相比，AE 組中IP3R 表達升高（P＜0.05）；與AE組相比，FAM134B過表達組IP3R表達顯著升高，FAM134B低表達組顯著降低（P＜0.05）；NC組與AE組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3B。

圖3 A：各組海馬神經元LC3-Ⅱ/Ⅰ的表達水平；B：各組海馬神經元IP3R蛋白表達水平Figure 3 A：The LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰratios of different groups in hippocampal neurons; B：The IP3R levels of different groups in hippocampal neurons

2.4 各組神經元內質網與線粒體之間的鈣離子交換與CON組相比，AE組中內質網Ca2+濃度降低，而線粒體Ca2+濃度升高（P＜0.05）；與AE 組相比，FAM134B 過表達組內質網Ca2+濃度增加，而線粒體Ca2+濃度降低，FAM134B低表達組內質網Ca2+濃度降低，而線粒體Ca2+濃度增加（P＜0.05）；NC 組與AE 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖4。

圖4 A：各組海馬神經元內質網Ca2+濃度；B：各組海馬神經元線粒體Ca2+濃度Figure 4 A: ER Ca2+ concentrations in hippocampal neurons of different groups; B: Mitochondrial Ca2+concentrations in hippocampal neurons of different groups

2.5 電鏡下觀察各組神經元線粒體超微結構CON組中線粒體雙層膜結構清楚，嵴致密且排列整齊；AE組和NC 組中線粒體結構被破壞，可見線粒體腫脹，嵴排列紊亂，內部空泡樣變性；FAM134B過表達組線粒體結構損傷較AE組顯著減輕，FAM134B低表達組較AE組顯著加重，可見明顯線粒體腫脹及內部空泡樣變性。見圖5。

圖5 各組海馬神經元線粒體電鏡下超微結構Figure 5 Ultrastructure of mitochondria under electron microscope in hippocampal neurons of different groups

2.6 各組神經元的CytC釋放和caspase-3活化與CON 組相比，AE 組中CytC 釋放和caspase-3 活化增加（P＜0.05）；與AE 組相比，FAM134B 過表達組CytC釋放和caspase-3活化減少，FAM134B低表達組CytC釋放和caspase-3 活化增加（P＜0.05）；NC 組與AE 組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖6。

圖6 各組海馬神經元線粒體CytC、胞質CytC及Caspase-3活化Figure 6 The levels of mitochondrial and cytosolic CytC and cleaved caspase-3 in hippocampal neurons of different groups

3 討論

本研究發現過表達FAM134B 減少MAMs 中IP3R表達，減少內質網與線粒體間Ca2+交換，抑制線粒體凋亡途徑，減少無鎂外液致癇海馬神經元凋亡，而降低FAM134B 表達則發揮相反作用，表明FAM134B介導的內質網自噬通過調節無鎂外液致癇海馬神經元MAMs 對神經元線粒體鈣穩態和凋亡發揮保護作用。

內質網是細胞內最大的膜性細胞器，在蛋白質折疊和鈣信號傳導方面發揮重要作用［11］。為了維持細胞內環境的穩定，內質網可根據細胞應激條件調整其形狀和大小［12］。研究發現內質網膜的動態變化受內質網自噬調控，各種應激條件，如鈣離子異常、氧化應激均可誘發內質網應激，繼而激活內質網自噬［13］。內質網自噬可通過降解受損內質網、未折疊蛋白質和清除冗余內質網膜維持內質網體積及功能［3，14］。FAM134B 作為介導內質網自噬的重要受體，可誘導內質網片段化，通過其包含的內質網同源結構域促進內質網膜重構，并通過LIR結合自噬相關蛋白LC3促進內質網與溶酶體結合降解多余的內質網膜，控制內質網的體積以維持細胞穩態［5］。本研究表明，FAM134B過表達明顯增加體外癲癇海馬神經元中自噬標記物表達且減輕致癇神經元凋亡，而降低FAM134B表達則起相反作用，提示FAM134B可以調節體外癲癇神經元內質網自噬水平，在神經元凋亡中起重要作用。

Ca2+是細胞的第二信使，在細胞新陳代謝、細胞死亡和存活等多個過程中發揮重要調節作用［1］。內質網作為細胞內最重要的Ca2+儲存庫，在癲癇發作時可釋放大量Ca2+進入胞質，線粒體可通過攝取過量Ca2+發揮代償作用維持細胞穩態［15］。內質網與線粒體之間的連接部位MAMs 與多種生理過程如內質網應激、線粒體穩態、Ca2+信號調控和細胞凋亡等密切相關，可使Ca2+快速進入線粒體［16］。IP3R作為MAMs中重要的鈣離子通道，可通過介導內質網Ca2+釋放在內質網與線粒體之間形成高鈣微區使線粒體內Ca2+濃度升高［8］。同時，IP3R可與MAMs中其他Ca2+相關蛋白如電壓依賴性陰離子通道和伴隨蛋白葡萄糖調節蛋白相互協作，促進線粒體Ca2+攝取［17］。本研究發現，無鎂外液致癇海馬神經元中IP3R水平升高，內質網Ca2+濃度降低，而線粒體Ca2+濃度升高，提示癲癇可能通過提高MAMs中IP3R水平增加內質網與線粒體間的Ca2+交換。FAM134B過表達顯著降低了體外癲癇海馬神經元IP3R 表達，減少了內質網與線粒體間Ca2+交換，而降低FAM134B表達則起相反作用，提示FAM134B 可調節MAMs 中的IP3R 水平和內質網與線粒體之間的Ca2+交換，在癲癇線粒體鈣離子穩態及神經元凋亡中發揮重要作用。

研究表明，線粒體在誘導細胞程序性凋亡或死亡過程中發揮重要作用［18］。線粒體Ca2+攝取是調控線粒體代謝和內質網穩態的關鍵，但過量Ca2+進入線粒體時將進一步導致線粒體發生功能障礙［19］。研究發現，IP3R 介導內質網釋放大量Ca2+轉移至線粒體內將引起線粒體鈣超載［17］。線粒體鈣超載可導致線粒體通透性轉換孔開放，誘發線粒體膜電位去極化、呼吸鏈與氧化磷酸化解耦連，進而導致線粒體基質腫脹甚至外膜破裂［20］。CytC 位于線粒體內膜上，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在線粒體凋亡途徑中發揮重要作用。線粒體鈣超載時，CytC 可由開放的線粒體通透性轉換孔從線粒體膜間隙釋放到胞漿間隙。胞漿中的CytC 與凋亡蛋白酶活化因子-1（APAF-1）相互作用結合形成凋亡小體，募集激活caspase-9，而caspase-9將進一步激活下游的凋亡因子caspase-3［20-21］。caspase-3的激活在神經元凋亡中發揮極其重要的作用，可活化線粒體凋亡途徑，進而導致細胞死亡［22］。本研究發現，體外癲癇海馬神經元中線粒體存在明顯損傷，CytC 釋放和caspase-3活化增加。FAM134B過表達可以減輕癲癇海馬神經元線粒體損傷，抑制癲癇海馬神經元CytC 釋放和caspase-3 活性，而低表達FAM134B 發揮相反作用，提示FAM134B 可能通過調節線粒體介導的凋亡途徑對癲癇神經元凋亡發揮重要作用。

FAM134B 介導的內質網自噬可能對無鎂外液致癇海馬神經元線粒體鈣穩態及凋亡發揮保護作用，其機制可能為通過調節MAMs 中的IP3R 水平改變內質網與線粒體之間的Ca2+交換，減輕線粒體損傷，減少CytC的釋放，抑制線粒體凋亡通路的激活。