用HPLC 法同時測定自制復方特比萘酚軟膏中3 個主藥成分的含量

嚴 佳，宋洪濤，周 欣 （中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院藥劑科，福建 福州 350025）

淺部真菌病是由致病真菌（皮膚癬菌、念珠菌、馬拉色菌等）所致的淺表真菌感染，為皮膚科高發的感染性疾病，以足癬發病率最高，而趾間糜爛型和水皰型為最主要的發病類型。部隊官兵作訓任務重、居住環境艱苦，且常年穿著透氣性較差的膠鞋、作戰靴，戰士間易交叉感染，是此類型疾病的高發人群。目前，足癬治療方案為外用抗真菌藥物，但臨床上使用的多為單方制劑，對治療合并有細菌感染伴有瘙癢癥狀的淺部真菌病效果較差，患者有時需使用兩種或兩種以上的藥物，因攜帶不便，導致依從性較低。因此，本實驗在前期研制復方酮康唑軟膏的基礎上[1]，擬選用鹽酸特比萘芬作為外用抗真菌藥替代酮康唑，制備一種外用復方制劑——復方特比萘芬軟膏，用于治療淺部真菌皮膚病并發細菌感染，以解決酮康唑化學性質不穩定、易變色的問題，也方便部隊官兵攜帶使用。同時，建立HPLC 法同時測定該復方制劑的3 個主要成分：特比萘酚、糠酸莫米松、莫匹羅星的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1 200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司，DAD 檢測器）；DV215CD 型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]。

1.2 試藥

鹽酸特比萘芬對照品（批號：100563-201402，含量99.8%）、莫匹羅星對照品（批號：130568-200501，含量94.2%）、糠酸莫米松對照品（批號：100930-201201，含量99.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院。鹽酸特比萘芬原料藥(批號：20150405)、莫匹羅星原料藥（批號：20150301）購自武漢鑫佳靈生物科技有限公司；糠酸莫米松原料藥（批號：20150228，浙江仙琚制藥股份有限公司）。聚乙二醇400、聚乙二醇3350（中國醫藥對外貿易公司），甲醇為色譜純，水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備[1]

2.1.1 鹽酸特比萘芬對照品溶液的制備

精密稱定鹽酸特比萘芬對照品10.2 mg，置10 ml量瓶中，用70%甲醇稀釋至每1 ml 含鹽酸特比萘芬1 020 μg 的對照品儲備液。精密移取鹽酸特比萘芬對照品儲備液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含量為102 μg/ml 的鹽酸特比萘芬對照品溶液。

2.1.2 莫匹羅星對照品溶液的制備

精密稱定莫匹羅星20.2 mg，置10 ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋至每1 ml 含莫匹羅星2020 μg 的對照品儲備液。再精密移取莫匹羅星的對照品儲備液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含量為202 μg/ml 的莫匹羅星對照品溶液。

2.1.3 糠酸莫米松對照品溶液的制備

精密稱定糠酸莫米松10.1 mg，置100 ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋至每1 ml 含糠酸莫米松101 μg的對照品儲備液。再精密移取糠酸莫米松的對照品儲備液1 ml 置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含量為10.1 μg/ml 的糠酸莫米松對照品溶液。

2.1.4 混合對照品溶液的制備

分別取鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松對照品儲備液各1 ml，置10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.5 供試品溶液的制備

精密稱取原料藥鹽酸特比萘芬1 g、莫匹羅星2 g、糠酸莫米松0.1 g，置100 ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品，同法制備3 份。精密吸取上述溶液1 ml 置100 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.6 陰性對照溶液的制備

按“2.1.5”項下，分別配制缺鹽酸特比萘芬、缺莫匹羅星、缺糠酸莫米松成分的溶液，即得陰性對照溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30），檢測波長248 nm，流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，進樣量10 μl。

2.3 專屬性試驗

分別取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液適量，濾過，取續濾液10 μl 注入HPLC 儀，分別記錄色譜圖。實驗結果表明，該方法專屬性良好，陰性對照無干擾。結果見圖1。

2.4 標準曲線制備及線性關系考察

分別精密吸取鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松對照品儲備液各0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、2 ml 置10 ml 量瓶中，用70%甲醇稀釋配制成含鹽酸特比萘芬濃度為20.4、40.8、81.6、102.0、122.4、142.8、163.2、204.0 μg/ml，含莫匹羅星濃度為40.4、80.8、161.6、202.0、242.4、282.8、323.2、404.0 μg/ml，含 糠 酸 莫 米 松 濃 度 為2.02、4.04、8.08、10.10、12.12、14.14、16.16、20.20 μg/ml的混合對照品溶液，濾過，取續濾液10 μl，按“2.2”項下色譜條件分析，記錄色譜圖，計算峰面積。以峰面積A對對照品濃度C（μg/ml）線性回歸。實驗結果表明，鹽酸特比萘芬在20.4～204.0 μg/ml 濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為A=1.905×10C+25.90，r=0.999 7；莫匹羅星在40.4～404.0 μg/ml濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為A=2.440C+1.446，r=0.999 8；糠酸莫米松在2.02～20.20 μg/ml濃度范圍內線性關系良好，回歸方程為A=2.838×10C+15.12，r=0.999 7。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一份混合對照品溶液6 次，每次10 μl，分別注入HPLC 儀，記錄峰面積，計算RSD值。鹽酸特比萘酚、莫匹羅星、糠酸莫米松RSD（n=6）分別為0.05%、0.12%、0.25%，實驗結果表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一批供試品6 份，按“2.1.5”項下方法制備供試品溶液，濾過，取續濾液按“2.2”項下色譜條件分析，分別記錄色譜圖，測定峰面積，計算含量。鹽酸特比萘酚、莫匹羅星、糠酸莫米松RSD（n=6）分別為0.19%、0.08%、0.44%，實驗結果表明，RSD 均小于1%，方法重復性良好。

圖1 復方特比萘芬的HPLC 圖

2.7 穩定性試驗

取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h取樣10 μl 注入HPLC 儀，測定并計算不同時間點莫匹羅星、糠酸莫米松和鹽酸特比萘芬的含量。鹽酸特比萘酚、莫匹羅星、糠酸莫米松RSD（n=6）分別為0.66%、0.77%、0.57%。結果表明，供試品溶液在24 h 內穩定。

2.8 回收率試驗

分別精密量取“2.1.1”、“2.1.2”、“2.1.3”項下鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松的對照品儲備液各0.8、1、1.2 ml，分別置于3 個10 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得低、中、高3 種濃度的混合對照品溶液，每個濃度平行配制3 份。濾過，棄去初濾液，取續濾液10 μl 注入HPLC儀，測定并計算。實驗結果表明，鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松平均回收率分別為（99.39±0.82）%、（99.21±0.59）%、（99.97±0.81）%，說明此方法回收率符合要求。

2.9 樣品含量測定結果

按“2.1.5”項下配制供試品3 批，每批3 份，精密稱取供試品1 ml，置于100 ml 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液9 份，測定，外標法計算藥物含量。結果見表1。

表1 樣品含量測定結果(n=3， ±s，%)

表1 樣品含量測定結果(n=3， ±s，%)

供試品 莫匹羅星 糠酸莫米松 特比萘芬1 99.32±0.26 100.8±0.37 100.2±0.38 2 99.95±0.26 101.2±0.52 101.8±0.56 3 100.3±0.87 101.4±0.72 100.5±1.04

3 討論

3.1 最大吸收波長的選擇

紫外光譜掃描結果顯示，鹽酸特比萘芬在282 nm具有最大吸收峰，莫匹羅星在220 nm 處具有最大吸收峰，糠酸莫米松在248 nm 處具有最大吸收峰。由于3 個組分中糠酸莫米松含量較低，僅占處方量的0.1%，而鹽酸特比萘芬占1%，莫匹羅星占2%。故為了讓這3 種藥物能同時測定并保證糠酸莫米松的響應值，確定鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松的檢測波長為248 nm，在此波長下3 種主藥均有較好的響應值，建立的HPLC 法回收率試驗結果符合要求。

3.2 色譜條件的選擇

筆者曾首先嘗試以甲醇-pH5.5 磷酸鹽緩沖液（65∶35）作為流動相，色譜柱選用C18柱[2]，結果顯示該色譜條件下，鹽酸特比萘芬出峰時間太長，而莫匹羅星及糠酸莫米松的出峰時間偏早，且雜峰較多；還曾嘗試以甲醇-水、甲醇-醋酸銨、甲醇-乙腈-水、乙腈-水等、甲醇-0.1%磷酸溶液、四氫呋喃-乙腈-四甲基氫氧化銨緩沖液[3-10]作為流動相，試驗結果表明，甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30）作為流動相，C8色譜柱的條件下，鹽酸特比萘芬出峰時間明顯提前，三大主藥出峰時間都在20 min 以內，基線平穩，各峰分離度良好；但該條件下鹽酸特比萘芬的峰型對稱性不佳，有拖尾現象。故在此基礎上，考慮莫匹羅星（弱酸性）[11-12]，實驗又嘗試通過調節流動相pH 改善峰型，發現在pH7.5 時，鹽酸特比萘芬具有良好的對稱性，但莫匹羅星與糠酸莫米松拖尾嚴重。為保證大部分主藥的峰型良好，本課題最終選用色譜條件為C8色譜柱，甲醇-0.1%磷酸溶液（70∶30）作為流動相。實驗采用HPLC 法，建立同時測定鹽酸特比萘芬、莫匹羅星和糠酸莫米松的含量測定方法，所建立的分析方法簡便、準確、靈敏度高，陰性對照無干擾。