不同產地藤茶中二氫楊梅素含量及其與牛蒡子配伍的藥效學研究

孫 睿，付 麗，雷 雨 （. 北京碧生源藥業有限公司，北京，0433；. 上海交通大學醫學院，上海，0040）

藤茶即顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata(Hand.-Mazz.) W. T. Wang，是葡萄科蛇葡萄屬的一種野生木質落葉藤本植物，俗稱藤茶、白茶等。其產地主要分布于湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等地[1]。我國壯族和瑤族百姓，以及產地居民將其幼嫩莖葉經揉制、干燥制成保健茶，用于感冒、發熱、咽喉腫痛、瘡癤等癥，至今已有數百年的歷史[2-3]。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）為藤茶中主要的二氫黃酮醇類化合物，既往研究證實二氫楊梅素具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、解酒保肝、抗病原微生物及調血脂等多方面的藥理作用[4-5]。牛蒡子（Fructus arctii）又名大力子、鼠粘子、惡實等，為菊科二年生草本植物牛蒡（Arctium lappaL.）的干燥成熟果實。具有疏散風熱、宣肺祛痰、利咽透疹和解毒消腫的功效[6-7]。筆者通過研究藤茶不同產地、部位、加工工藝的二氫楊梅素含量，進一步完善藤茶的質量標準。評價優選藤茶與牛蒡子配伍的清咽功效，為進一步開發清咽功能保健食品提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材與試劑

藤茶植物原料于2018 年6～8 月采自湖南、湖北、福建、貴州不同鄉鎮，所有采集的原植物均經藥學高級工程師雷雨博士鑒定為葡萄科蛇葡萄屬植物顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata）的莖葉部位。不同植株采收間隔不小于300 m，單株不同采收方式及部位分為人工采收（芽尖、嫩葉、粗老葉、茶梗）、機器采收；藤茶（批號：20180620，貴州江口梵凈山云峰野生植物開發有限公司）；牛蒡子（批號：171101，安國市深豪藥業有限公司）；藤茶牛蒡子濃縮液：取采收地為貴州江口縣的芽尖部位優選藤茶及牛蒡子的復配樣品105.0 g（藤茶63.0 g，牛蒡子42.0 g），常壓、溫度80 ℃，提取2 次，每次各用1 050 ml無菌水浸泡30 min，將提取液合并濃縮至70 ml，以下簡稱“復配樣品”；二氫楊梅素對照品（99.57 %，MMST-18031501，中國科學院成都生物研究所成都曼思特生物科技有限公司）；甲醇（色譜純，Fisher Chemical）；純水（MLMP-1-20T，四川優普超純科技有限公司優普系列超純水器）；磷酸（90 %，BCBD9465，Fluka）；乙醚（國藥集團化學試劑北京有限公司）；碘伏（山東利爾康牌醫療科技股份有限公司）。

1.2 儀器

安捷倫高效液相色譜儀（Agilent 1 290，DAD檢測器）；超聲波儀器（上海睿祺電子設備有限公司）；QHAMS 型精密十萬分之一天平；FW100 型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；XRYLS-25A 型電動耳腫打孔器（上海欣軟信息科技有限公司）；電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；微量加樣器（Hamilton）。

1.3 動物

SPF 級SD 大鼠，雄性，體重（185 ± 15）g，10 周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]。SPF 級BALB/c 小鼠，雄性，體重（20 ± 2）g，6 周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008]。實驗動物飼養于北京聯合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF 級動物室 [許可證號：SYXK（京）2017-0038]。分籠飼養，控制室溫（25 ± 2）℃，自由攝食、飲水。維持飼料由北京華阜康生物科技股份有限公司 [許可證號：SCXK（京）2019-0008] 生產。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；甲醇-0.05 %磷酸水溶液（30∶70）為流動相；流動相流速：1 ml/min；檢測波長291 nm；柱溫25 ℃；進樣量10 μl；運行時間20 min；理論塔板數按二氫楊梅素計算不低于3 000。二氫楊梅素保留時間為8.37 min，如圖1 所示獲得樣品色譜圖。

圖1 二氫楊梅素對照品（A）及貴州江口梵凈山藤茶樣品（B）的HPLC 圖

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱定二氫楊梅素對照品12.72 mg，置于10 ml 容量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經0.45 μm 濾膜過濾，制得1.272 mg/ml 儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備

樣品拆袋，混合均勻，粉碎。精密稱定樣品約0.05 g 于100 ml 容量瓶中，加70 %乙醇，超聲提取30 min。取出后冷卻至室溫，加入70 %乙醇定容至刻度，搖勻，靜置。經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，供液相色譜分析用。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

采用逐級稀釋法，量取適量二氫楊梅素儲備液，至于10 ml 容量瓶中，加70 %乙醇定容，制得濃度分別為0.019 9、0.039 8、0.079 5、0.159、0.318 mg/ml。以進樣濃度（mg/ml）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），固定進樣量為10 μl，繪制標準曲線，回歸方程為：Y= 165 202X+ 482.04（r=0.999），表明二氫楊梅素對照品在0.019 9～0.318 mg/ml范圍內線性關系良好。

2.3.2 儀器精密度考察

精密吸取二氫楊梅素系列對照品溶液0.079 5 mg/ml，按規定色譜條件重復進樣6 次，每次進樣10 μl，記錄二氫楊梅素的峰面積值，重復6 次進樣峰面積的RSD 為0.60 %，表明該方法的儀器精密度良好。

2.3.3 方法重復性考察

稱取同一樣品6 份，按照“2.2.2”項制備供試品溶液進行重復性試驗，二氫楊梅素平均含量為14.23%，RSD 為1.24 %，表明該方法重現性良好。

2.3.4 方法穩定性考察

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進行測定，二氫楊梅素峰面積RSD 為1.41 %，表明供試品溶液在12 h 內基本穩定，該方法穩定性良好。

2.3.5 加樣回收率考察

按9 份樣品中二氫楊梅素含量的1.2 倍，1.0 倍，0.8 倍，分別準確加入二氫楊梅素對照品。按照“2.2.2”供試品制備方法制備供試液，HPLC 進樣檢測，計算加樣回收率。該樣品二氫楊梅素的加樣回收率在95.04 %～100.4 %之間，平均回收率為97.53 %，RSD 為2.00 %，表明本方法的準確度良好，具體結果見表1。

綜上，方法學考察結果表明本研究建立的提取和分析方法能夠滿足藤茶中二氫楊梅素定量分析的要求。

2.4 數據處理

2.5 樣品含量測定

供試品溶液進樣10 μl，通過回歸方程計算不同采收點藤茶芽尖部位的二氫楊梅素含量。結果17 批樣品中二氫楊梅素含量介于18.60 %～37.69 %之間，含量較高的采樣點在湖南省八大公山、貴州省江口縣、貴州省羅場鄉，較低的采樣點多為湖北及福建一帶。具體見表2。

表1 藤茶中二氫楊梅素加樣回收率的試樣結果（n =9）

表2 不同采收點芽尖部位藤茶中二氫楊梅素的含量（ ±s， n =6）

表2 不同采收點芽尖部位藤茶中二氫楊梅素的含量（ ±s， n =6）

采樣點 含量（%） 不同地區含量（%）湖北恩施 20.80±1.2 24.33±8.1湖北來鳳1 18.60±1.1湖北來鳳2 33.60±1.0福建將樂1 30.30±0.6 29.47±1.2福建將樂2 28.63±0.9湖南八大公 37.69±0.5 31.66±5.0湖南張家界1 33.67±0.3湖南張家界2 29.83±0.9湖南張家界3 30.39±1.2湖南張家界4 30.43±0.6湖南武陵山1 22.83±0.5湖南武陵山2 36.81±0.8貴州江口1 35.50±0.6 32.26±2.9貴州江口2 31.40±0.8貴州江口3 30.60±0.7貴州羅場1 35.11±1.0貴州羅場2 28.69±0.5

相對于湖南省張家界各采收點差異范圍（29.83 %～33.67 %），貴州省江口縣（30.60 %～35.50 %）、貴州省羅場鄉（28.69 %～35.11 %）、湖北省來鳳縣（18.60 %～33.60 %）、湖南省武陵山地區（22.83 %～36.81 %），藤茶芽尖部位中DMY 含量出現較大浮動。貴州省總體采收藤茶芽尖含量水平最高，其次為湖南省。

2.5.1 不同采收部位及加工方式樣品含量測定

自然曬干法指將新鮮采集的樣品攤開，于陽光下曬至全干；自然陰干法指新鮮采集的樣品攤開，于陰涼干燥通風處晾至全干。選擇總體含量較高且含量趨于平穩的貴州省江口縣2 號采收地樣品，利用人工采收手法收集同一植株的芽尖、嫩葉、粗老葉及茶梗樣品，同時利用機器采收同一植株樣本。而后利用不同干燥方式進行加工處理，含測結果如表3 所示。

表3 同一采收地點不同部位及加工方式二氫楊梅素含量（ ±s ，n =6）

表3 同一采收地點不同部位及加工方式二氫楊梅素含量（ ±s ，n =6）

注：1.采收地點為貴州省江口縣2號點。2.芽尖部位用自然曬干加工方式其二氫楊梅素含量最高，平均含量為35.85 %。

采收部位 自然曬干含量（%） 自然陰干含量（%）芽尖 35.85±0.4 32.22±0.8嫩葉 26.22±0.5 28.32±0.6粗老葉 15.84±0.5 16.02±0.5茶梗 15.32±0.2 15.47±0.2機器采收 20.40±1.0 20.77±0.9

2.6 樣品清咽功效考察

2.6.1 對受試動物一般狀態和體重的影響

受試動物精神狀態、行為活動、攝食攝水等均未見明顯異常。給予復配樣品前后，各劑量組大鼠、小鼠的體重與空白對照組比較均無顯著性差異。

2.6.2 大鼠棉球植入致炎模型

大鼠低、中、高劑量組分別給予0.38、0.75、2.25 g/kg 復配樣品原藥材折算濃縮液灌胃，同時設空白對照組0 g/kg。經口給予大鼠復配樣品36 d，實驗結束前8 d，用脫毛器脫去大鼠兩側腹股溝處的毛，乙醚麻醉大鼠，碘伏消毒，在無菌條件下切開大鼠兩側腹股溝皮膚，植入經高壓滅菌并烘干、稱重的棉球，縫合切口，繼續給予復配樣品。實驗結束當天，給予復配樣品1 h 后，斷頸處死大鼠，在原縫合處剪開皮膚，剝離并取出棉球肉芽組織，置于已稱重的潔凈平皿中，恒溫干燥箱60 ℃開蓋干燥1 h 后稱重，計算肉芽腫凈重量。

由表4 可見，經口給予大鼠復配樣品36 d 后，與空白對照組比較，中劑量組（0.75 g/kg）和高劑量組（2.25 g/kg）大鼠肉芽腫凈量降低，其中，中劑量組具有顯著性差異，高劑量組具有極顯著性差異，說明該劑量下的復配樣品可顯著改善大鼠棉球植入致炎率。

2.6.3 小鼠耳腫脹致炎模型

小鼠低、中、高劑量組分別給予0.75、1.50、*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，與空白對照組比較。4.50 g/kg 復配樣品原藥材折算濃縮液灌胃，同時設空白對照組0 g/kg。經口給予大鼠復配樣品36 d，實驗結束當天，吸取二甲苯20 μl，滴加在小鼠右耳外側面耳郭的中央，讓其自由擴散，30 min 后，將小鼠脫頸椎處死，剪下雙耳，用9 mm 直徑打孔器在兩耳相同部位打下耳片并稱重，以兩耳重量之差為耳郭腫脹值，計算耳郭腫脹率。

表4 大鼠棉球植入實驗肉芽腫凈量（ ±s ，n =12）

表4 大鼠棉球植入實驗肉芽腫凈量（ ±s ，n =12）

組別 給藥劑量（g/kg） 肉芽腫（m/mg）空白對照組 0.00 428.2±65.4低劑量組 0.38 392.3±45.3中劑量組 0.75 372.6±58.9*高劑量組 2.25 347.3±20.9**

由表5 可見，經口給予小鼠復配樣品36 d 后，各劑量組小鼠耳郭腫脹率與空白對照組比較均有降低，且差異具有統計學意義。

表5 小鼠耳腫脹實驗耳郭腫脹率（ ±s， n =15）

表5 小鼠耳腫脹實驗耳郭腫脹率（ ±s， n =15）

*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，與空白對照組比較。

組別 給藥劑量（g/kg） 耳郭腫脹率（%）空白對照組 0.00 74.8±24.3低劑量組 0.75 64.2±11.9中劑量組 1.50 59.8±13.8*高劑量組 4.50 53.7±7.8**

3 討論

本研究考察了湖北、湖南、貴州、福建等不同產地藤茶有效成分二氫楊梅素的含量，采樣點所在地為顯齒蛇葡萄主產區[8-9]，其中種植于貴州省江口縣的藤茶無論在不同產地功效成分含量還是同一產地不同植株含量穩定性上都相對較好。藤茶以芽尖嫩葉多為佳，粗老葉、茶梗較多會影響藤茶整體品質和功效。該研究數據可作為企業收購原料參考指標，用于判定藤茶產品中二氫楊梅素的含量情況，為生產及研發提供依據。

經口給予本配伍樣品36 d 后，高劑量組大鼠肉芽腫凈量及小鼠耳郭腫脹率均顯著低于空白對照組。該復配樣品對大、小鼠體重增長均無不良影響。據結果判定大鼠棉球植入結果及小鼠耳腫脹治療效果均呈陽性，可認定該配伍樣品具有清咽功能。綜上所述，該藤茶及牛蒡子配伍樣品在動物致炎模型中發揮了消炎作用。

吸煙、飲酒等不良習慣加大群眾患急慢性咽炎的概率，具有清咽功能保健食品的開發需求迫在眉睫[10]，本著中醫藥主張未病先治的理論，筆者將繼續對本配伍藥效及安全性進行深入研究。