升陷湯及單味藥材水提物對缺氧/復氧致心肌損傷的保護作用

金曉玲，陳 嵐，張 鳳，黃豆豆，廖麗娜，陳萬生,3 （. 海軍軍醫大學附屬長征醫院藥材科，上海 00003；. 空軍杭州特勤療養中心療養三區藥械科，浙江 杭州 3000；3. 上海中醫藥大學中藥研究所，上海 003）

1960 年，Jenning 首次提出了心肌再灌注損傷的概念[1]。心肌缺血/再灌注損傷的主要原因包括氧自由基增多、細胞內鈣超載及微血管損傷等[2-3]，缺血組織細胞恢復灌注后發生的再灌注損傷（MIRI）在恢復血流的過程中常會引起心肌細胞的氧化應激損傷[4-5]，往往造成患者預后不佳[6]。

升陷湯出自張錫純《醫學衷中參西錄》，該方由黃芪、柴胡、升麻、桔梗、知母組成，主治大氣下陷之證，臨床廣泛用來防治心肌缺血性疾病[7]、治療老年慢性充血性心力衰竭[8]、治療不穩定型心絞痛[9]、治療青少年病毒性心肌炎[10-11]。課題組前期考察了升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞的保護作用[12]，尚未見升陷湯對心肌細胞缺氧/復氧損傷模型保護作用的報道。本實驗基于經典的心肌細胞缺氧/復氧損傷模型[13]，從細胞凋亡的角度初步探討升陷湯及單味藥對心肌缺氧/復氧的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

純凈水（美國Millipore 公司）、Fura-3/AM（碧云天生物技術有限公司）、生理鹽水（海軍軍醫大學附屬長征醫院）；0.25%胰蛋白酶溶液（Gibco 公司）；DMEM 低糖培養基、培養液（美國Hyclone 公司）；MTT 工作液（美國sigma 公司）；二甲基亞砜（德國GmbH 公司）；PBS 緩沖液（南京滴純生物科技有限公司）；胎牛血清（美國Gibco 公司）；DCFHDA（碧云天生物有限公司）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）；16%甲醛（無甲醇，賽默飛世爾科技有限公司）；其他試劑為分析純。

倒置熒光顯微鏡（重慶奧特光學儀器）；流式細胞儀（美國BD 公司）；全自動酶標儀（美國Multiskan MK3 公司）；CO2細胞培養箱（德國Heraeus 公司）；低溫高速離心機（德國Heraeus 公司）；臺式高速離心機（德國Eppendorf 公司）；熒光顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；二氧化碳培養箱（美國Forma 公司）；79-1 型磁力攪拌器（江蘇周莊科研儀器廠）；YJ-II 型超聲波細胞粉碎機（上海新芝生物技術研究所）；海爾低溫冰箱。

1.2 藥物的制備

升陷湯中五味藥材飲片由長征醫院藥材科提供。將5 L 水浸泡升陷湯全方提取物或各單味藥材24 h 后，再煎煮，重復3 次，將濃縮水煎煮液合并至650 ml，干燥得提取物浸膏。其中，升陷湯組方飲片（簡稱藥物SXT）包括黃芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g 和升麻100 g。SXT、黃芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液蒸干后的浸膏重量分別為431.2、187.5、89.5、45.2、43.5、28.1 g。將所有提取物分別研細，于-20°C 冰箱中保存備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 H9C2 大鼠心肌細胞株的培養

H9C2 細胞培養在含10% FBS 的高糖DMEM培養液、37 ℃、5% CO2、95% O2飽和濕度的恒溫細胞培養箱，待細胞匯合度達到80%～90%進行傳代培養。傳代時，棄去培養液，用PBS 緩沖液洗2～3 次后用含0.25%胰蛋白酶消化液消化細胞，待細胞變圓時立刻停止消化，以1 000 r/min 離心5 min。棄上清液，用含10% FBS 的DMEM 培養基重懸后，并按1∶3 分瓶，隔天更換培養液。取對數生長期細胞進行試驗。

1.3.2 模型的復制和藥物干預

將心肌細胞隨機分為以下8 組：對照組：心肌細胞正常培養基培養；模型組：心肌細胞用低糖無血清培養基預孵育1 h 后，在含95% N2和5%CO2的培養箱中缺氧6 h，再在5% CO2和95%空氣飽和的培養箱復氧1 h 造成心肌缺血損傷模型組；藥物干預組：心肌細胞用低糖無血清培養基稀釋的藥物預孵育1 h 后，經缺氧6 h-復氧1 h 處理后即為藥物干預組。其中，干預藥物包括SXT、黃芪、知母、柴胡、桔梗和升麻水提液（共6 組）。

1.4 檢測指標

1.4.1 心肌細胞活力的測定

培養完成后，將對照組和模型組組以及藥物干預組中取對數期生長的細胞接種于96 孔板，調整細胞的濃度使每孔有5×105個細胞，然后向每孔中加入20 μl MTT（5 mg/ml）工作液，孵育一段時間，后向每孔中加入150 μl DMSO，室溫條件先低速震蕩讓二者充分融合，然后參照MTT 比色法試劑盒說明，在490 nm 測定各孔下的吸光值，分別記錄結果。模型組、各藥物干預組與對照組的比值為細胞活力相對值。

1.4.2 活性氧（ROS）含量的變化

培養完成后，分別收集所有組中懸浮細胞，在各組細胞中加入150 μl DCFH-DA 溶液，在37 ℃細胞培養箱內避光孵育30 min。每隔5 min 震蕩1 次，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液將細胞洗幾遍，最后用PBS 重懸。采用多功能酶標儀檢測細胞內ROS 活性（激發波長488 nm，檢測波長525 nm）。

1.4.3 細胞內鈣離子濃度的變化

培養結束后，用0.25%胰酶消化離心，分別將所有組中細胞用緩沖液PBS 沖洗，再與10 μmol/L鈣離子熒光探針Fura-3/AM（10）共同孵育60 min，然后用緩沖液沖洗2 次，最后用PBS 重懸。將制成的標本置于倒置熒光顯微鏡下，用340 nm 紫外光激發獲得熒光圖像，經過計算機圖像處理后根據標準曲線算出細胞內鈣濃度。

1.4.4 AnnexinV-FITC/PI 雙染檢測細胞凋亡

培養完成的細胞用不含 EDTA 的胰酶消化，離心收集懸浮細胞，2 000 r/min 離心5 min，棄培養基；用預冷的PBS 洗滌細胞；加入100 μl 結合緩沖液懸浮細胞，濃度約為 1 × 106/ml；然后在細胞懸浮液中加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻后于 4 ℃避光條件下孵育 15 min；再加入 5 μl PI 后輕輕混勻于 4 ℃ 避光條件下孵育5 min；添加PBS 至500 μl并輕輕震搖均勻，于60 min 內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.5 統計學處理方法

使用GraphPad Prism v5.0 統計軟件進行統計學分析，實驗數據以（±s）表示，組內兩兩比較采用t-test，當P＜ 0.05 時判定差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物對缺氧/復氧損傷后心肌細胞活力的影響

本實驗根據臨床給藥劑量及預實驗結果，在藥物試驗濃度分別為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0、160.0 和320.0 μg/ml 的藥物浸膏時，研究全方及各單味藥對心肌細胞缺氧/復氧后細胞活力的影響。MTT 結果顯示：升陷湯、黃芪、知母、桔梗、升麻在20 μg/ml 時，細胞活力最佳，因此確定上述提取物濃度組均為20 μg/ml；由于20 μg/ml 柴胡提取物對心肌細胞有一定損傷，經試驗最終確定藥物濃度為0.3 μg/ml 時對缺氧/復氧后細胞活力無明顯影響（表1）。

表1 升陷湯各單味藥對缺氧/復氧造成的心肌細胞活力的影響

2.2 藥物對缺氧/復氧損傷后心肌細胞內ROS 的影響

實驗結果表明：心肌細胞在缺氧/復氧條件下，細胞內活性氧含量明顯增加，升高至對照組的2.49 倍（P＜0.01，圖1），表明缺氧/復氧引起細胞內自由基損傷；給藥后，除柴胡外，升陷湯全方及各單味藥均能明顯降低心肌缺氧/復氧致心肌損傷模型的細胞內ROS 的熒光強度，升陷湯全方、黃芪、知母、桔梗和升麻處理組分別為對照組的1.46、1.40、1.79、1.52 和1.83 倍（P＜0.01，圖1）。其中，升陷湯與黃芪作用最強，兩者無明顯統計學差異。

2.3 藥物對缺氧/復氧損傷后心肌細胞內鈣離子的影響

圖1 藥物對心肌缺氧/復氧細胞凋亡的影響

實驗結果表明：心肌細胞在常氧下（對照組），Ca2+熒光強度較低，缺氧/復氧后，Ca2+熒光強度增加（P＜0.01，圖2），表明心肌細胞低氧/復氧時存在Ca2+超載。升陷湯全方和黃芪、知母藥物干預后，各組細胞內熒光強度與模型組相比，分別降低了15.20%、23.98%和15.79%（P＜0.05，圖2），表明其對低氧/復氧時心肌細胞內Ca2+超載有抑制作用。桔梗、升麻藥物處理后，上述值雖然有降低，但差異不明顯。

圖2 藥物對心肌缺氧/復氧細胞內ROS 含量的影響

2.4 藥物對缺氧/復氧損傷后心肌細胞凋亡的影響

采用Annexin V-FITC/Pl 雙染流式細胞術檢測藥物對缺氧/復氧損傷后心肌細胞凋亡情況。從檢測結果發現，心肌細胞在常氧下（對照組），細胞凋亡較低；缺氧/復氧后，細胞凋亡增加；給藥組中升陷湯全方、黃芪、桔梗可以降低細胞的凋亡率（P＜0.05，圖3）。

圖3 藥物對心肌缺氧/復氧細胞內鈣離子濃度的影響

3 討論

心肌細胞缺氧/復氧損傷是模擬MIRI 的病理生理過程的經典模型，心肌細胞短時間內缺血再灌注造成的組織細胞功能代謝發生障礙及結構功能破壞加重，甚至發生不可逆性損傷的現象[14]。Ca2+超載一直被認為是心肌缺血再灌注的主要機制。缺血缺氧時，心肌細胞內Ca2+超載，線粒體膜的通透性轉換孔開放；再灌注恢復使得心肌細胞重新攝取O2，產生大量的線粒體內活性氧，進一步增加線粒體胞質內的Ca2+濃度，線粒體的氧化磷酸化進而受阻促使心肌細胞死亡[15-16]。另外，線粒體內活性氧觸發氧化應激反應并加重心肌細胞的凋亡和壞死[17-19]。由此可見，細胞內ROS 活性和Ca2+濃度是MIRI 重要的檢測指標[20-21]。

本課題組前期采用大鼠冠狀動脈結扎急性心肌缺血致慢性心力衰竭模型，心肌組織病理學切片證實了升陷湯全方對心肌細胞損傷和炎癥發展起到有效的控制作用，通過藥理指標測定結合代謝組學研究證實了升陷湯對心衰具有顯著的治療作用。升陷湯通過改善心肌細胞損傷，減少炎癥反應，增強左室射血功能，調節機體磷脂代謝和脂肪酸生物合成來發揮其保護心肌作用，從而治療慢性心力衰竭[22-23]。本課題組通過體外細胞實驗從缺氧/復氧致心肌細胞損傷角度，基于心肌細胞活力角度考察并證實了升陷湯的保護作用，可通過抑制細胞凋亡、降低細胞內ROS 以及Ca2+的濃度實現。同時，發現各單味藥也具有一定的保護作用，但弱于全方的保護功效，進一步證實了全方治療“大氣下陷”的合理性。升陷湯全方是以黃芪補氣升陷為主藥，知母涼潤制主藥之溫燥，柴胡、升麻助黃芪升陷之力，桔梗載藥力上達胸中，共奏升補大氣之效[24]。藥材柴胡提取液在本實驗中尚未發現具有保護缺氧/復氧損傷心肌細胞的作用，在一定程度上證實了其他藥味配伍的合理有效性。