基于網絡藥理學對降脂護肝膠囊干預脂肪肝的機制研究

蔡孟成，金永生，鄭 巍，袁梓珂，郭良君 （1. 海軍軍醫大學：a.基礎醫學院，b.藥學院，上海 00433；. 陸軍第七十二集團軍醫院藥械科，浙江 湖州，313000）

脂肪性肝病（脂肪肝）是由各種原因引起的以肝細胞彌漫性脂肪變為病理特征的一種臨床綜合征，多數患者伴有代謝性疾病、心血管疾病與膽道系統疾病。根據流行病學調查研究顯示：全球25%的成人患有脂肪肝，我國脂肪肝的患病率高達27%且有逐漸年輕化的趨勢[1]。脂肪肝可逐步發展為肝炎、肝硬化甚至肝癌，故而早期干預脂肪肝的發展是保障廣大人民健康與減輕國家醫療負擔的重要舉措。現代醫學主要通過調整生活方式、應用抗肝損傷及抗代謝紊亂的藥物（如他汀類）進行治療。目前，中西醫結合治療脂肪肝越來越被當代社會推崇。降脂護肝膠囊是原湖州福音醫院中醫科老中醫趙文敏主任醫師多年的經驗用方，于20 世紀90 年代已在該院推廣使用，并形成院內協定處方。其由山楂、姜黃、茵陳、葛根和決明子五味中藥組成，具有平肝降脂、活血化瘀的作用，將其與西藥配合應用對脂肪肝的治療效果顯著[2-3]，但其作用機制尚不明確。本文旨在應用網絡藥理學的方法對降脂護肝膠囊的作用機制進行探究，以期為日后的實驗研究與臨床應用提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥物靶點的篩選

本研究采用計算系統生物學實驗室的中藥系統藥理學數據庫和分析平臺 (TCMSP；http://lsp. nwu.edu.cn/tcmsp.php) 與Traditional Chinese Medicines Integrated Database (TCMID；http://119.3.41.228:8000/tcmid/search/) 檢索中藥姜黃、茵陳、葛根和決明子的活性成分。因山楂在TCMSP 數據庫中未收錄，筆者應用TCMID 對山楂進行活性成分檢索，利用TCMID 對其余中藥的活性成分進行補充。根據化合物口服生物利用度 (OB) 與類藥性(DL) 進行篩選，OB 閾值設為 OB≥30%，DL 閾值設為 DL≥0.18[4-5]。此外，由于齊墩果酸、熊果酸、葛根素、姜黃素和6,7-二甲氧基香豆素等化合物已被證實具有較好的降脂作用，而且在降脂護肝膠囊中的含量也較高，故將上述化合物也納入活性成分范圍內[6-8]，并通過TCMSP 數據庫獲取成分靶點。

1.2 疾病靶點的收集

以 “fatty liver” “liver steatosis”等為關鍵詞檢索 GeneCard（https://www.genecards.org/）數據庫與OMIM 數據庫（https://omim.org/），收集與脂肪肝相關的作用靶點[9]。

1.3 構建化合物-靶點網絡

為明確疾病靶點與藥物靶點之間的關系，將兩部分靶點進行交集，輸入 Cytoscape 軟件構建化合物-靶點網絡。Cytoscape 軟件的核心架構是網絡，每個節點是基因或活性成分，節點與節點之間的連接代表這些生物分子之間的相互作用，節點的度值代表網絡中節點與節點相連的數目，度值越大說明該活性成分或靶點處于越核心的位置。

1.4 構建蛋白相互作用網絡

為更深層次探究靶點之間的相互作用關系，將交集所得的共同靶點上傳至線上軟件String10.5(http://stringdb.org)，構建蛋白相互作用網絡。物種選擇為 Homosapiens，置信度設置為＞0.9，其余參數保持默認設置，獲取 PPI 網絡。

1.5 生物過程與通路分析

利用 R Project 中的 org.Hs.eg.db 程序包（http://www.bioconductor.org/packages/ release /data /annotation/html/org.Hs.eg.db.html）將基因 symbols 轉變為 Entrez IDs，進而利用 clusterProfiler 程序包（3.6版）（http://bioconductor.org/packages http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/clusterProfiler.ht ml）對網絡進行 GO 分析和 KEGG 通路分析。設定P＜0.05，并按照涉及的靶點數目多少進行排序，獲取 GO 富集分析的前20 個條目以及 KEGG 富集的前 20 條信號通路[10]。

2 結果

2.1 潛在活性成分的篩選與對應靶點的收集

通過TCMSP 數據庫檢索到決明子活性成分68 個，姜黃活性成分52 個，葛根活性成分18 個，茵陳活性成分53 個，通過TCMID 數據庫檢索到山楂活性成分94 個，茵陳活性成分58 個，姜黃活性成分109 個，葛根活性成分51 個，決明子活性成分57 個。根據OB≥30%與DL≥0.18，篩選出決明子活性成分14 個，葛根活性成分4 個，茵陳活性成分13 個，姜黃活性成分3 個，山楂活性成分3 個。將山楂中的齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸、金絲桃苷、表兒茶素，葛根中的葛根素、黃豆苷元，姜黃中的姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、二氫姜黃素與茵陳中的濱蒿內酯，納入活性成分范圍。其中，MOL000358（β-谷甾醇）為茵陳和葛根的共有成分，MOL000953（膽甾烷醇）為姜黃和決明子的共有成分，MOL000449（豆甾醇）為決明子和姜黃的共有成分。按照類別計數符合標準的活性成分共計46 個，部分化合物見表1。通過TCMSP數據庫獲取上述中藥活性成分的靶點，除去重復靶點，共獲得靶點133 個。

2.2 疾病相關靶點的篩選

從GeneCard 與OMIM 數據庫去除重復基因后，獲得與脂肪肝相關的靶點7 406 個。

2.3 化合物-靶點網絡構建

將“2.1”中的133 個降脂護肝膠囊活性成分靶點與“2.2”中的7 406 個脂肪肝靶點，輸入Venny2.1軟件繪制韋恩圖，兩者進行交集后，獲得疾病-藥物成分共同靶點118 個，見圖1。采用Cytoscape 軟件構建的活性成分-靶點網絡，該網絡共包含157 個節點(39 個化合物節點，118 個靶點節點)和327 條邊，其中，紅色節點表示化合物，綠色節點表示藥物靶點，連接化合物與靶點的邊表示它們之間有作用關系，見圖2。表2 列出了化合物-靶點網絡中的關鍵節點、類別及其度值。活性成分度值排名前5 位 的 是 槲 皮 素（ quercetin） 、 黃 豆 苷 元（daidzein）、熊果酸（ursolic acid）、葛根素（puerarin）和異鼠李素（isorhamnetin），這5 種化合物的節點數分別是71、37、27、25 和16。靶點度值排名前5 位的是前列腺素過氧化物合酶1（PTGS1）、核受體共激活因子2（NCOA2）、絲氨酸蛋白酶1（PRSS1）、雌激素受體2（ESR2）和雄激素受體（AR），分別能與26、17、13、11 和11 個化合物發生相互作用，體現了中藥多成分、多靶點的特性。

表1 降脂護肝膠囊部分活性成分

圖1 降脂護肝膠囊化學成分作用靶點與脂肪肝相關病例靶點交集分析

2.4 PPI 網絡的構建與分析

應用String 軟件構建PPI 網絡(圖3)，在此網絡圖中包含103 個節點、474 條邊，同時得到網絡中關鍵靶點的頻次 (圖4)。根據“度值＞均值”篩選出關鍵節點38 個，包括：CCND1、ESR1、EGFR、RELA、FOS、NCOA1、MAPK8、APOB、IL6、NCOA2、PRKCA、RB1、AR、ATF2、RHOA、CASP3、CASP8、CCNB1、ERBB2、PCNA、VEGFA、CYP1A1、GSK3B、MYC、PPARG、CDKN1B、CTSD、HIF1A、P4HB、PSMD3、BARD1、BCL2、CHRM2、ESR2、IGFBP3、NOS3、PGR、PTPN6。度值最高的是CCND1，度值為17；其次為ESR1，度值為16；EGFR、RELA 的度值為15，FOS、NCOA1 度值為14。度值大的靶點提示在網絡調控中起關鍵作用，且很可能是降脂護肝膠囊治療脂肪肝的關鍵靶點。

2.5 GO 與KEGG 富集分析

GO 富集條目（圖5）主要包括：DNA 結合轉錄因子結合、RNA 聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子結合、核受體活性、配體激活轉錄因子活性、DNA 結合轉錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、DNA 結合轉錄激活活性、類固醇激素受體、類固醇結合、整合素結合、核受體結合等。KEGG 富集信號通路（圖6）主要包括：PI3K-Akt 信號通路、人巨細胞病毒感染、癌癥中的微小RNA、乙型肝炎、EB 病毒感染等。其中，PI3K-Akt 信號通路的靶點主要包括：GF、RTK、CK、CKR、GPCR、PKC、NOS、 Raf、 GSK3、 Myc、 CCND1、 p27、 Cyclin、p27Kip1、Bcl-2、CASP9、CREB、Mcl-1、NF-?B。乙型肝炎的靶點主要包括：Fas、JNK、c-Myc、SAPK、 NF-?B、 I?B、 Bcl2、 CASP8、 CASP3、CASP9、 pRb、 PKC、 Survivin、 ATF2、 CREB、PCNA、Raf、AP-1、ELK-1、IL6（圖7、圖8）。

3 討論

圖2 降脂護肝膠囊活性成分-靶點網絡

表2 化合物-靶點網絡的關鍵節點及其度值

中醫學認為脂肪肝病位在肝，病因主要與過食肥甘厚膩、嗜酒無度有關，疾病早期多為脾失健運，痰濕內生，濕郁化熱；疾病后期多見熱灼營陰，煉液成痰，痰瘀互結，故而脂肪肝在早期應以清利濕熱為主，在后期當在清利濕熱的基礎上佐以活血化瘀。臨床上脂肪肝患者早期無特征性癥狀，故而容易被患者忽視，當疾病進展到一定程度，患者才來到醫院尋求治療。降脂護肝膠囊以清利濕熱、祛瘀活血為治療原則，對脂肪肝后期具有良好的治療作用。方中山楂消食化積、行氣活血、降脂化濁，茵陳清利濕熱、疏肝護肝，兩者針對痰瘀互結之病機根本，共為君藥；葛根通經活絡，解酒毒降脂為臣藥；決明子清肝通便泄濁，姜黃活血行氣為佐使藥。現代藥學研究表明，山楂的主要化學成分主要有槲皮素等黃酮類化學成分，以及熊果酸等三萜酸及綠原酸、檸檬酸等有機酸等。研究表明，其中總黃酮及三萜酸等化學成分是山楂降脂作用的主要活性成分，可以抑制低密度脂蛋白的氧化修飾，減少脂質過氧化物的形成，發揮降血脂的作用[11-13]。茵陳的化學成分主要有6,7-二甲氧基香豆素類、綠原酸、對羥基苯乙酮和揮發油等化學成分，這些成分也是茵陳的降脂和保肝的主要活性成分[14-16]。葛根的化學成分主要有葛根素等異黃酮化合物，這類化合物具有降脂和保肝作用，是葛根降脂作用的主要活性成分[17-19]。決明子的主要化學成分為蒽醌類物質，研究表明決明子蒽醌能減少腸道對膽固醇的吸收，增加排泄，能抑制血清膽固醇升高和主動脈粥樣硬化斑點形成，能明顯增加血清 HDLC 含量及提高HDL-C/TCM 比值，通過反饋調節LDL 代謝，降低血清膽固醇水平，延緩和抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成，改善體內膽固醇的分布[20-21]。姜黃的主要化學成分為姜黃素類不飽和二酮類物質，研究表明姜黃素具有降低高脂血癥大鼠血清TC 及LDL-C 的作用，對家兔的動脈粥樣硬化形成也有抑制作用[22-23]。此外，姜黃還可以增強阿伐他汀的降血脂作用[24]。綜上，降脂護肝膠囊具有明確的中醫學理論指導與物質基礎，本文旨在通過網絡藥理學探究降脂護肝膠囊的作用機制，以期推廣其臨床應用。

圖3 降脂護肝膠囊蛋白質-蛋白質相互作用網絡

圖4 降脂護肝膠囊作用的關鍵靶點

圖5 降脂護肝膠囊GO 富集分析

圖6 降脂護肝膠囊KEGG 富集分析

本研究運用網絡藥理學研究方法共篩選出降脂護肝膠囊中的活性成分39 個，作用靶點118 個，體現了中藥多成分、多靶點聯合作用的整體性和關聯性的特點。根據“活性成分-靶點”網絡結果，進一步得到排名前5 的關鍵化合物為槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素。現代研究表明，槲皮素主要通過抗氧化應激與抑制炎癥小體激活改善胰島素抵抗，從而減少脂質堆積并調節脂質代謝[25-27]；黃豆苷元在通過抗氧化改善脂代謝紊亂的同時可以調節能量代謝，其機制可能與棕色脂肪組織中解偶聯蛋白1 的表達增加有關[28-30]；熊果酸與葛根素主要通過抑制炎癥反應發揮減少脂肪堆積的作用，其作用機制主要與上調AMPK 和PPARa的表達,及下調SREBP-lc 和ACC 的表達有關[31-33]；現代研究表明，50 mg/kg 劑量口服異鼠李素可以抑制小鼠肝內三酰甘油的含量，同時肝損傷標記物也得到相應改善，但其作用機制有待探究[34]。綜上，降脂護肝膠囊可能是通過槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素等活性成分發揮抗氧化應激與抑制炎癥反應干預脂肪肝的。

圖7 PI3K-Akt 信號通路圖

圖8 乙型肝炎通路圖

根據PPI 網絡分析結果和“活性成分-靶點”網絡結果，降脂護肝膠囊干預脂肪肝的主要作用靶點有周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受體1（ESR1）、表皮生長因子受體（EGFR）等，其中，CCND1 與炎癥反應和能量代謝有關；ESR1 與EGFR 除了與炎癥反應相關外，還與血管生成有關，脂肪肝患者多伴有胰島素抵抗，其并發癥如肥胖癥、高血壓、糖尿病等可能會誘發新生血管疾病，如視網膜病變。GO 功能富集分析結果發現，降脂護肝膠囊活性成分主要涉及氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、激素抵抗等生物學過程；KEGG 通路富集主要涉及PI3K-Akt 信號通路、人巨細胞病毒感染、癌癥中的微小RNA、乙型肝炎、EB 病毒感染等信號通路，高相關度的通路主要包括炎癥通路、病毒感染與癌癥通路通路。PI3K-Akt 可以調控各種不同細胞的功能，如代謝、生長、增殖、存活等；乙型肝炎通路主要與乙肝病毒感染的炎癥反應相關。現代研究表明，脂肪肝與代謝以及炎癥反應高度相關，在代謝紊亂的基礎上，乙肝病毒感染使得炎癥反應進一步加劇，可逐漸轉變為不同類型的肝炎，若不及時干預可進一步發展為肝纖維化、肝硬化，甚至肝癌。綜上所述，降脂護肝膠囊可能是通過槲皮素、黃豆苷元、熊果酸、葛根素和異鼠李素等活性成分通過抑制炎癥反應、抗氧化應激兩條途徑改善脂代謝，降低脂肪堆積，并防止脂肪肝進一步向肝癌方向轉化，體現了一定的保肝作用。網絡藥理學分析是中醫藥基礎研究的重要手段，但是基于中醫藥理論藥材配伍的特點，還應當考慮中藥活性成分的含量以及成分與成分之間的協同作用關系，這需要通過后續對海量數據處理算法的研發，此外，還需要通過實驗驗證網絡藥理學得出的結果以增強說服力。但無論如何，網絡藥理學的結果對臨床應用與實驗研究都具有一定的指導意義。