基于網絡藥理學對茵連痛風顆粒抗炎鎮痛作用的機制研究

徐 熠，劉 靜，黃 瑾，崔金剛 （. 上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院藥劑科，上海 00437；. 上海市中醫藥研究院中西醫結合臨床研究所，上海 00437）

痛風在中醫理論中屬于“痹證”、“白虎歷節”范疇[1]。中醫辨證分型主要有濕熱蘊結型、寒濕痹阻型、肝腎虧虛型、痰瘀痹阻型、瘀血阻滯型、脾虛濕盛型和寒熱錯雜型[2]，在治療上主要以泄濁利濕、通絡止痛為主[3]。茵連痛風顆粒為上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院自制制劑，是著名夏氏外科傳人夏涵教授數十年的經典經驗方。該制劑由茵陳、連錢草和伸筋草三味中藥組成，用于治療間歇期痛風性關節炎[4]。茵連痛風顆粒的成分多樣，前期研究中發現其不同部位群對痛風模型大鼠均有不同程度的抗炎鎮痛作用[5]，但其作用有效成分和疾病靶標的關系尚不明確，抗炎鎮痛作用可能與香豆素[6]、黃酮、有機酸[7]、三萜類、生物堿類以及蒽醌類[8]等成分有關。因此，筆者采用網絡藥理學方法對茵連痛風顆粒的抗炎鎮痛作用機制進行分析，預測茵連痛風顆粒的主要活性成分和潛在靶標部位，以期為該制劑建立臨床療效的質量評估體系提供支持。

1 材料與方法

1.1 茵連痛風顆粒活性成分及靶點的篩選

本研究利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)[9]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢 索獲得茵連痛風顆粒中三味中藥的化學成分，通過TCMSP 篩選出化學成分對應的數據，預測成分的口服利用度(OB) 和類藥性(DL)[10]，以OB≥30%且DL≥0.18 作為篩選條件，篩選出活性成分，再將其依次輸入TCMSP，查找得到潛在的靶點蛋白，并通 過Uniprot 數 據 庫（https://www.uniprot.org/）[11]匹配蛋白所對應的基因。

1.2 茵連痛風顆粒活性成分-預測靶點網絡的構建

將茵連痛風顆粒的活性成分及潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.cytoscape.org /），構建并預測茵連痛風顆粒的活性成分及靶點網絡。

1.3 抗炎鎮痛靶點的收集

基于OMIM 數據庫[12]檢索抗炎、鎮痛相關靶蛋白基因，搜索關鍵詞"pain"、"ache"、"soreness"、"inflammation"、"inflammatory"，所有靶標均通過UniProt 數據庫獲取其UniProt ID 信息。

1.4 茵連痛風顆粒蛋白互作網絡的構建

將OMIM 中獲取到的蛋白質信息導入STRNG數據庫，篩選出蛋白相互作用分值＞0.7 的高置信數據[13]，用Cytoscape 3.7.2 構建與抗炎鎮痛有關的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI) 網絡。

1.5 網絡合并

利用Cytoscape 3.7.2 中的Merge 功能，將茵連痛風顆粒活性成分-預測靶點網絡與抗炎鎮痛的PPI 網絡合并，確定兩者共有的潛在作用靶點。通過Cytoscape3.7.2 構建茵連痛風顆粒活性成分-潛在靶點網絡，并分析茵連痛風顆粒抗炎鎮痛的潛在靶點。

1.6 通路及生物過程的富集分析

采用David v6.8 數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)[14-16]，對與抗炎鎮痛相關的茵連痛風顆粒活性成分-潛在靶點網絡中的蛋白進行基于基因組百科全書(KEGG)的生物通路富集分析，并利用OmicShare 對通路進行可視化，采用Davidv6.8數據庫，對與抗炎鎮痛相關的茵連痛風顆粒活性成分-潛在靶點網絡中的蛋白進行基因本體GO 功能富集分析[13]。

2 結果

2.1 茵連痛風顆粒活性成分篩選

在TCMSP 數據庫中搜索“茵陳”、“連錢草”、“伸筋草”三味中藥的化學成分，共得到175 個化學成分，以OB≥30%且DL ≥0. 18 作為篩選條件，刪除無對應靶點的成分，共獲得23 個潛在有效成分（表1），其中，茵陳和連錢草共有成分為槲皮素和β-谷甾醇[17]（圖1）。

表1 茵連痛風顆粒23 個有效活性成分及其OB 及DL 值

2.2 茵連痛風顆粒活性成分-靶點網絡的構建

將篩選出的23 個茵連痛風顆粒潛在有效成分導入到TCMSP，查找相應的靶點，得到686 個潛在靶點蛋白，并利用Uniprot 數據庫匹配對應基因。將結果導入到Cytoscape 3.7.2 軟件中進行網絡構建，得到茵連痛風顆粒活性成分靶點網絡（圖2）。該網絡包含228 個節點、686 條邊，紅色六邊形表示茵陳特有的活性成分、紫色六邊形表示連錢草特有的活性成分、綠色六邊形表示伸筋草特有活性成分、黃色箭頭表示兩個成分共有的活性成分、粉色菱形表示單味藥的作用靶點、湖綠色菱形表示兩味藥共同的作用靶點、藍色菱形表示三味藥共同的作用靶點。如圖2 所示，23 個茵連痛風顆粒的活性成分均具有多靶點，不同靶點可對應相同成分，不同的成分可對應相同的靶點。

圖1 茵連痛風顆粒有效活性成分韋恩圖

2.3 抗炎鎮痛靶點信息的收集和篩選

在OMIM 數據庫檢索與抗炎鎮痛相關的基因，共檢索到286 個相關基因靶點。與茵陳活性成分共有32 個共同靶基因，與連錢草活性成分共有35 個共同靶基因，與伸筋草活性成分共有7 個共同靶基因（圖3）。

2.4 茵連痛風顆粒抗炎鎮痛靶標蛋白-蛋白相互作用分析及網絡可視化構建

將茵連痛風顆粒預測所得的基因與抗炎鎮痛相關基因進行映射后得到共有靶基因，輸入STRNG 數據庫進行蛋白-蛋白相互作用分析。在分析過程中，選取物種為Homosapiens，并將蛋白-蛋白互作得分＞0.7 的基因輸入Cytoscape 3.7.2 進行網絡可視化，共有37 個節點，285 個連線。應用軟件中的NetworkAnalysis plugin 對網絡圖中節點進行統計，分析其在圖中的作用，自由度越大，該節點在網絡中的生物功能則越多。同時，顏色越深代表該節點自由度較大、生物功能較多（圖4）。進一步對與抗炎鎮痛潛在靶點網絡進行分析，網絡中有17 個靶點的自由度值大于平均度值15.41，預測可能為茵連痛風顆粒活性成分發揮抗炎鎮痛療效的潛在靶點。

2.5 GO 功能和KEGG 通路的富集分析

圖2 茵連痛風顆粒主要活性成分-靶點網絡

圖3 茵連痛風顆粒活性成分相關基因與抗炎鎮痛相關基因

圖4 茵連痛風顆粒抗炎鎮痛蛋白-蛋白相互作用圖

圖5 茵連痛風顆粒抗炎鎮痛靶點的GO 富集

利用David 平臺進行GO 功能富集分析，得到了293 個GO 條目，根據P＜0.05 篩選出211 個GO條目，針對前10 條BP 分析、CC 分析、MF 分析繪制直方圖（圖5）。其中，生物過程條目170 條，主要包括炎癥反應、基因表達的正調控、IL -6 的正調控等；細胞組成條目16 個，主要包括I-kappaB/NFkappaB 復合體、細胞質核周區域、GABA-A 受體復合物等；分子功能條目25 條，主要包括細胞因子活性、酶結合、蛋白質異二聚活性等。

利用David 平臺的KEGG 通路富集分析功能，得到79 條信號通路，根據P＜0.001 篩選出50 條信號通路（圖6）；包括TNF 信號通路、NOD 受體信號通路、NAFLD、MAPK 信號通路、Ras 信號通路、核轉錄因子B 信號通路等。

2.6 活性成分-靶點-通路圖的構建

基于上述信息，構建活性成分-靶點-通路圖，以全面闡述茵連痛風顆粒抗炎鎮痛的作用機制（圖7）;圖中有112 個節點和462 條邊，綠色菱形代表茵連痛風顆粒活性成分，紅色圓形代表潛在靶點，黃色箭頭代表信號通路，邊代表三者之間的相互作用，節點越大表示其抗炎鎮痛的作用越大。

圖6 茵連痛風顆粒抗炎鎮痛關鍵靶基因KEGG 通路富集

圖7 茵連痛風顆粒抗炎鎮痛活性成分-靶點-信號通路網絡

3 討論

茵連痛風顆粒由茵陳、連錢草和伸筋草三味中藥組成，茵陳具有清利濕熱、利膽退黃的功效；連錢草具有利濕通淋，清熱解毒，散瘀消腫的功效；伸筋草具有祛風除濕、舒筋活絡的功效。三者合用增強了清熱利濕，通絡止痛的作用[18]。

本研究通過TCMSP、Uniprot 數據庫篩選潛在的抗炎鎮痛活性成分，得出槲皮素、β-谷甾醇、茵陳色原酮、異鼠李素等23 個黃酮類、甾體類成分。這些成分與現有文獻報道中關于抗炎鎮痛的活性成分相符[19-22]。其中，共有成分槲皮素為黃酮類化合物，有研究表明槲皮素對炎癥反應具有良好的抑制作用，對化學刺激疼痛模型和熱刺激疼痛模型均有顯著的鎮痛作用[23]。共有成分β-谷甾醇為甾體類化合物，具有類似于氫化可的松的抗炎活性，其抗炎機制主要是通過局部免疫調節來發揮抗炎作用[24]。

通過OMIM 數據庫、STRNG 數據庫及Cytoscape軟件構建抗炎鎮痛靶標蛋白-蛋白交互網絡，揭示茵連痛風顆粒通過多靶點起到抗炎鎮痛的作用。本研究共得到PTGS2、TNF、IL-6、IL-10 等37 個茵連痛風顆粒抗炎鎮痛的關鍵靶點。前列腺素內過氧化物合酶PTGS），又稱為環氧合酶（COX），存在兩個亞型，即COX-1 和COX-2[25]。PTGS2 產生炎癥性前列腺素，參與炎癥的發生，同時與其他預測所得出的靶點都有密切聯系[26-27]。TNF[28]、IL-6有致痛和痛覺增敏的作用，IL-10 有活性較強的抗炎作用，除具抑制促炎細胞因子的產生外，還能促進其他抗炎因子的產生、下調促炎因子受體的表達[29]。PTGS2 等靶點是抗炎鎮痛的關鍵靶點，在炎癥反應、基因表達等生物過程中起著至關重要的作用。

KEGG 富集結果表明，茵連痛風顆粒抗炎鎮痛關鍵靶點基因顯著富集在TNF 信號通路、MAPK信號通路、核轉錄因子B 信號通路等。茵陳中的黃酮類成分具有重要的抗炎活性，其潛在的抗炎機制可能與其對NF-κB 和MAPK 信號通路的抑制有關[6]。研究表明[30]，茵陳色原酮通過JNK 途徑激活轉錄因子E2 相關因子2（Nrf2）及其下游靶標血紅素加氧酶1（HO-1）水平，減弱LPS 誘導的小膠質細胞炎癥反應，也可有效抑制MyD88 和Toll/IL-1 接頭蛋白（TIRAP）介導的信號通路，進而抑制LPS 誘導的NF-κB、蛋白激酶B（Akt）和MAPK 激活的炎癥基因活化，從而發揮抗炎作用。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學，對茵連痛風顆粒抗炎鎮痛的多成分、多靶點和多信號通路進行相關性研究，初步揭示了茵連痛風顆粒中三味中藥的抗炎鎮痛分子機制，為進一步開展和實驗驗證茵連痛風顆粒抗炎鎮痛作用機制提供理論依據。