敲減MCCC2 對前列腺癌細胞系DU145 增殖、遷移和凋亡的影響

陳 雪，黃澤豪，鄭承劍 （. 福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350；. 海軍軍醫大學藥學院，上海 00433）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球范圍內第二位最常見的男性癌癥，也是全球第二大致死癌癥[1]。據統計，我國前列腺癌的發病率呈逐年上升的趨勢，其中，上海地區該病的發病率和病死率較高，但總體而言，亞洲國家前列腺癌的發病率明顯低于西方國家[1-3]。在前列腺癌的治療中，局限性前列腺癌常規行根治性前列腺切除術或放射治療，而對于進展期患者則需要接受內分泌治療即雄激素阻斷治療（androgen deprivation therapy，ADT）。雖然ADT 在早期可以明顯抑制激素依賴性前列腺癌的進展，但是隨著治療時間的延長，激素依賴性前列腺癌會逐漸失去對ADT 的反應而轉化成為去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer,CRPC），目前對CRPC 尚無有效的治療方法。因此，亟需深入挖掘CRPC 病程進展中的關鍵基因和蛋白，為CRPC 提供潛在治療靶標。

Abula 等[4]進行了PCa 蛋白質組學文獻的數據挖掘，發現了前列腺腫瘤組織和正常組織中41 種差異表達蛋白，并構建了蛋白相互作用網絡。其中，3-甲基巴豆酰輔酶A 羧化酶β 亞基（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase β subunit，MCCB）就是其中的重要差異蛋白之一。MCCB 是生物素依賴性羧化酶（3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）的兩個組成亞基之一，由563 個氨基酸組成[5-8]，MCCC2是該蛋白的編碼基因。已有研究報道，MCCC2是一種致癌基因，與包括肝細胞癌、結直腸癌以及乳腺癌在內的多種腫瘤的形成和發展密切相關[9-11]，有望成為腫瘤治療干預的潛在靶標。

在本研究中，我們主要探討了MCCC2與前列腺癌的關系。首先，采用慢病毒與質粒構建了穩定低表達MCCC2的DU145 細胞株并通過Western blot 和qPCR 分析敲減率；然后，系統考察敲減MCCC2對DU145 前列腺癌細胞的增殖、遷移以及凋亡的影響，明確下調MCCC2與DU145 細胞系腫瘤生物學特性的改變的相關性。

1 實驗材料

1.1 細胞株

人前列腺癌DU145 細胞，來源于海軍軍醫大學附屬長海醫院泌尿外科，培養于含10%胎牛血清的RPMI 1 640 培養基中。

1.2 材料與試劑

CCK-8 試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司）；兔MCCC2 多克隆抗體、GAPDH 抗體以及HRP 標記山羊抗兔二抗（美國CST 公司）；4%多聚甲醛固定液以及結晶紫染色液（碧云天生物技術有限公司）；細胞凋亡試劑盒（南京凱基生物有限公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養及轉染

DU145 細胞復蘇后接種于含10%滅活的胎牛血清，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 鏈霉素的DMEM培養液中，置于37 ℃，5% CO2細胞培養箱中生長，每隔3 d 傳代一次。將shRNA 質粒復合物加到含有細胞和培養基的培養板的孔中，來回輕柔搖晃細胞培養皿。細胞在CO2培養箱中37 ℃孵育24 ～48 h 進行轉染；再用嘌呤霉素篩選低表達MCCC2-DU145 的穩定細胞株。

2.2 細胞增殖實驗

將復蘇的細胞接種于大的培養皿中。3 d 后細胞以3×103個/孔，接種于96 孔板。分別在0、24、48、72、96 h 后，加CCK-8 試劑，在450 nm 處測定A值，根據A值分析結果。

2.3 細胞總蛋白提取

取 出DU145 細 胞、 NC-DU145 細 胞 以 及shMCCC2-DU145 細胞，棄掉上清，加入PBS 緩沖液洗3 次，每次1 ml；加入細胞裂解液（Western 及IP 細胞裂解液∶PMSF = 100∶1），吹打細胞，置冰上裂解20 min；收集細胞裂解液于1.5 ml 的EP 管中，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min；上清液即為提取的細胞總蛋白溶液，可用于BCA 法定量；加入5 ×蛋白加樣緩沖液，沸水中煮5 min，于-20 ℃保存，可用于后續的Western blot 實驗。

2.4 Western blot

配膠，撿漏，加入樣品，先將電壓調為80 V，待marker 條帶分離后，將電壓調制120 V，直到蛋白樣品跑至凝膠底部，停止電泳；恒流250 mA，冰浴90 min 的條件下轉膜；染色，封閉，再孵育MCCC2抗體以及二抗，置于Tanon5200 光密度掃描儀中進行拍照；用Image J 灰度分析差異性蛋白條帶。

2.5 細胞RNA 提取

將復蘇的細胞接種于培養皿中，待對數生長期時，細胞以5 × 105個/孔接種于6 孔板中，在37 ℃，5% CO2的恒溫培養箱中孵育；48 h 后，將培養基吸掉，加入PBS 洗滌3 次，每次1 ml；加入RA2 裂解液，每孔500 μl，置于冰上1 min；將裂解液收集于內套管中，在12 000 r/min 下離心1 min；取出，將外套管中的液體倒去，向內套管中加入500 μl 洗液，在12 000 r/min 下離心1 min；重復上述步驟一次；重復上述步驟，但是這次不加洗液，在12 000 r/min 下離心1 min；取出，棄去外套管，將內套管移入新的1.5 ml Ep 管中，加入30 μl 的洗脫液，室溫靜置2 min，在12 000 r/min 下離心1 min；得到總的RNA，并測定其濃度。

2.6 cDNA 的制備

按照1 000 μg 逆轉錄，總反應體系為20 μl。反應條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，30 s；4 ℃，永恒。反應體系見表1。

2.7 RT-qPCR

反應條件：94 ℃預變性30 s 后94 ℃ 10 s，60 ℃30 s，共進行40 個循環后，進行溶解曲線的檢測。反應體系見表2。

表1 逆轉錄反應體系

表2 RT-qPCR 的反應體系

2.8 Transwell 遷移實驗

進行Transwell 實驗以評估細胞在體外的遷移能力。細胞用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌2 次，用胰蛋白酶消化，稀釋為每毫升含1 × 106個細胞，在Transwell 室中，加入200 μl 含1% FBS 培養基的細胞液，下層用600 μl 含10% FBS 培養基處理。置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養48 h，然后用棉簽小心地擦去未穿過小孔的細胞，再用4%多聚甲醛固定30 min，最后用結晶紫染色1 h。使用倒置顯微鏡拍攝細胞照片，Image-Pro Plus 6.0 分析實驗結果。

2.9 細胞凋亡實驗

將細胞以5 × 105/孔的比例接種于6 孔板中，37 ℃孵育48 h。使用Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒，按照說明書操作方法，使用流式細胞術檢測細胞凋亡。

2.10 數據分析

數據分析通過SPSS (21.0)統計軟件進行，采用單因素方差分析，實驗結果用（±s）表示。與對照組比較，P＜ 0.05，則認為差異具有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 建立MCCC2 低表達DU145 細胞株

通過Western blot 檢測PC3、C4-2 和DU145細胞中MCCC2的表達水平。如圖1A 和圖1B 所示，MCCC2在DU145 細 胞 中 的 表 達 為（0.56 ±0.05）；MCCC2在PC3 細 胞 中 的 表 達 為（0.24 ±0.04）；MCCC2在C4-2 細 胞 中 的 表 達 為（0.32 ±0.04）。結果表明MCCC2在DU145 細胞中的表達水平高于C4-2 和PC3 細胞。為了探討MCCC2在前列腺癌發生發展中的生物學作用，我們在DU145 細胞中通過慢病毒轉染穩定下調了MCCC2的表達。成功建立了低表達MCCC2的DU145 細胞株，如圖1C 和1D，Western blot 結果表明，shMCCC2 組的MCCC2表達水平明顯低于shNC 組（0.22 ± 0.02 對 0.61 ± 0.06，P＜ 0.001），而DU145 組與shNC 組無明顯差異（0.60 ± 0.06 對0.61 ± 0.06，P＞ 0.05）。qPCR 結果表明，shMCCC2組的MCCC2表達水平明顯低于shNC 組（0.36 ±0.04 對 1.0 ±0.00，P＜ 0.001），而DU145 組與shNC組無明顯差異（1.17 ± 0.01 對1.0 ± 0.00，P＞ 0.05，圖1E）。

圖1 MCCC2 在不同前列腺癌細胞系和shMCCC2 DU145 細胞中的表達水平

3.2 敲減MCCC2 對DU145 細胞生長的影響

采用CCK-8 檢測敲減MCCC2對細胞活力的影響。分別在0、24、48、72、96 h 后，加CCK-8 試劑，在450 nm 處測定A值，檢測細胞增殖情況。如圖2 所示，48 h 時，shMCCC2 組的增殖明顯低于shNC 組（1.16 ± 0.03 對 1.59 ± 0.07，P＜ 0.05），而DU145 組與shNC 組比較無明顯差異（1.47 ± 0.05對 1.59 ± 0.07，P＞ 0.05）。在72 h 時，shMCCC2 組的增殖明顯低于shNC 組（1.92 ± 0.03 對 2.57 ±0.08，P＜ 0.01），而DU145 組與shNC 組比較無明顯差異（2.43 ± 0.11 對2.57 ± 0.08，P＞ 0.05）。在96 h 時，shMCCC2 組 的 增 殖 明 顯 低 于shNC 組（2.24 ±0.04 對3.13 ± 0.15，P＜ 0.01），而DU145 組與shNC 組比較無明顯差異（2.93 ± 0.05 對3.13 ±0.15，P＞ 0.05）。由結果可以看出，敲減MCCC2能顯著抑制細胞增殖，并呈時間依賴性。

圖2 敲減MCCC2 對DU145 人前列腺癌細胞增殖的影響

3.3 敲減MCCC2 對DU145 細胞遷移的影響

我們采用Transwell 小室實驗法測定敲減MCCC2對細胞遷移的影響。采用Image-Pro Plus 6.0 分析實驗結果，計算細胞遷移率。如圖3A 和3B 所示，shMCCC2 組的跨膜DU145 細胞數量明顯少于shNC 組（23.96 ± 1.85 對49.73 ± 0.63，P＜0.001）；而空白對照組與shNC 組相比，跨膜DU145細胞數無顯著性差異（48.45 ± 1.26 對49.73 ± 0.63，P＞ 0.05）)。由此可見，敲減MCCC2可有效抑制前列腺癌細胞的遷移。

3.4 敲減MCCC2 對細胞凋亡的影響

圖3 敲減MCCC2 對DU145 人前列腺癌細胞遷移能力的影響

圖4 敲減MCCC2 對DU145 人前列腺癌細胞凋亡的影響

進一步利用Annexin V-APC/7-AAD 凋亡檢測試劑盒檢測了敲減MCCC2對DU145 細胞凋亡的影響。結果如圖4A 和4B 所示，shMCCC2 組DU145 細胞的凋亡率明顯高于shNC 組（12.64 ±0.30 對 3.68±0.02，P＜0.001）；空白對照組與shNC組相比，DU145 細胞的凋亡率無顯著性差異（5.30 ±0.02 對3.68±0.02，P＞0.05）。因此，敲減MCCC2可誘導DU145 前列腺癌細胞凋亡。

4 討論

圍繞CRPC 發生發展中的關鍵基因和蛋白，已有研究者采用蛋白組學和轉錄組學等多種組學技術深入挖掘PCa 中AR 等重要信號通路的關鍵調節蛋白、基因和潛在的疾病標志物，發現MCCB 是前列腺腫瘤組織和正常組織中差異表達的關鍵蛋白之一[4]，而編碼該蛋白的基因MCCC2為AR 信號通路調節的關鍵基因，在人類前列腺癌臨床樣本中顯著過表達，可作為潛在的腫瘤標志物[10]。

3-甲基巴豆酰基輔酶A 羧化酶（MCC）是一種生物素依賴的羧化酶，可將3-甲基巴豆酰基輔酶A 催化為3-甲基戊二酰輔酶A[5-6]，是亮氨酸降解途徑的重要一步。MCC 包含α（MCCA）和β（MCCB）兩個亞基，分別由MCCC1和MCCC2基因編碼[12-13]。MCC 在人體內主要表達于腎臟和肝臟中，它的缺陷可引起甲基巴豆酰甘氨酸尿癥，嚴重的可導致嬰兒期的死亡[14-16]。MCC 缺陷主要與MCCC1和MCCC2基因的突變有關[17-21]。人MCCC1位于染色體區域3q25-q27，具有19 個外顯子，而MCCC2位于染色體區域5q12-q13，由17 個外顯子組成[7-8]。迄今為止，人類基因突變數據庫中共報道了MCCC1基因的49 個突變和MCCC2基因的52 個突變[22]。近年來，越來越多的研究表明，MCCC2參與了包括肝細胞癌、結直腸癌以及乳腺癌在內等多種腫瘤的形成和發展[9-11]，其在不同腫瘤中發揮的重要作用有待進一步挖掘。

本研究主要探究了MCCC2與前列腺癌的關系。結果表明，敲減MCCC2可顯著抑制DU145前列腺癌細胞的增殖和遷移，并誘導細胞凋亡。研究結果提示，MCCC2可能在前列腺癌發生發展過程中發揮重要作用，有望成為治療前列腺癌的一個潛在新靶標。至今尚無針對其編碼蛋白MCCB 的選擇性抑制劑的報道，是前列腺癌治療藥物發現的潛在新方向。