豬增生性腸炎的診斷及其在豬群中感染的調(diào)查

肖童，魏黃思梧，劉昌錦，林敏，劉小蘭，胡換儀，鄧舜洲

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330045）

豬增生性腸炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)感染引起的一種以回腸和結(jié)腸隱窩內(nèi)未成熟的腸細(xì)胞發(fā)生腺瘤樣增生為特征的豬腸道傳染病。該病能夠引起保育豬和育肥豬不用程度的出血性或間歇性腹瀉、消瘦、生長(zhǎng)緩慢等癥狀。胞內(nèi)勞森菌屬于脫硫弧菌科勞森菌屬的革蘭氏陰性菌，早在1931年就有報(bào)道，曾被稱為彎曲菌樣微生物（CLO）[1]，患病豬日增重減少，飼料轉(zhuǎn)化率低，嚴(yán)重可導(dǎo)致死亡，對(duì)世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。胞內(nèi)勞森菌在臨床上主要表現(xiàn)為豬腸腺瘤病(PIA)和豬增生性腸病(PPE)，其嚴(yán)重程度、臨床癥狀與受感染動(dòng)物的年齡相關(guān)[3]。2020年7月份江西省某豬場(chǎng)出現(xiàn)疑似胞內(nèi)勞森菌的病例，對(duì)其進(jìn)行臨床解剖和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為胞內(nèi)勞森菌感染。并對(duì)該區(qū)域的其他7個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，查看該區(qū)域豬群的感染情況。

1 臨床癥狀

2020年7月份江西省某豬場(chǎng)肥豬采食正常，但生長(zhǎng)緩慢、體型瘦小，部分豬出現(xiàn)排黑色柏油狀稀糞便癥狀（圖1），體表蒼白，未出現(xiàn)死亡病豬。

圖1 血便

圖2 回腸黏膜增厚

2 病理解剖

對(duì)病豬解剖發(fā)現(xiàn)回腸黏膜增厚，出現(xiàn)隆起（圖2），并呈現(xiàn)特征性分支狀皺褶，表面濕潤(rùn)而無粘液。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 PCR檢測(cè)

按照Ezup動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒方法提取DNA,用普通PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示，擴(kuò)增出了581 bp左右的單一條帶。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上通過BLAST在線工具進(jìn)行比對(duì)，通過DNA STAR軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果序列進(jìn)行分析，結(jié)果顯示測(cè)序菌株（CEXU）與胞內(nèi)勞森菌參考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性為100%，且處于進(jìn)化樹同一分支（圖4）。

圖3 PCR檢測(cè)結(jié)果

圖4 序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

3.2 熒光定量PCR檢測(cè)

使用賽默飛VetMAXTML.intracellularis Kit對(duì)提取的核酸進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，樣品胞內(nèi)勞森菌陽性。

4 診斷

通過臨床診斷及病理解剖，初步診斷為胞內(nèi)勞森菌感染。經(jīng)過普通PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示樣品DNA和胞內(nèi)勞森菌疫苗均出現(xiàn)581 bp左右大小的目的條帶，而陰性對(duì)照沒有條帶；序列分析其與胞內(nèi)勞森菌參考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性為100%；又經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)為陽性。因此，上述病例可確診為胞內(nèi)勞森菌感染。

5 豬胞內(nèi)勞森菌在豬群中的感染調(diào)查結(jié)果

通過對(duì)7個(gè)豬場(chǎng)的326份糞便樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果如表1所示：不同豬場(chǎng)的陽性檢出率區(qū)間為16.67%～40.00%，其中225頭母豬陽性檢出率為29.33%，82頭保育豬陽性檢出率為35.37%，17頭育肥豬陽性檢出率為17.65%，2頭種公豬陽性檢出率為0%，平均陽性檢出率為30.06%。

表1 豬胞內(nèi)勞森菌在豬群中的感染調(diào)查結(jié)果份、%

6 討論

由于該病的病原胞內(nèi)勞森菌屬專性胞內(nèi)細(xì)菌，其分離和培養(yǎng)方法都不完善，并且該病經(jīng)常呈亞臨床癥狀，養(yǎng)殖者對(duì)其的重視程度不高，這在很大程度上影響了對(duì)豬增生性腸炎的診斷與防治。本研究通過對(duì)患病豬進(jìn)行臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，確診為胞內(nèi)勞森菌感染。后續(xù)對(duì)該地區(qū)7個(gè)豬場(chǎng)進(jìn)行隨機(jī)采樣，通過熒光定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)陽性率達(dá)30.06%,表明胞內(nèi)勞森菌在該地區(qū)存在流行性。

普通PCR在應(yīng)用于明顯患病動(dòng)物的組織樣品或糞便時(shí)具有良好的靈敏度，但檢測(cè)亞臨床癥狀的豬糞便往往會(huì)出現(xiàn)陰性結(jié)果[4]，本實(shí)驗(yàn)使用賽默飛熒光定量檢測(cè)試劑進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，準(zhǔn)確性和陽性檢出率更高。彭忠等建立一種套氏PCR方法檢測(cè)糞便中的胞內(nèi)勞森菌[5]，對(duì)1 000多份糞便樣品進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果表明該方法相較于普通PCR方法有較高的靈敏度和良好的特異性。劉立兵等建立胞內(nèi)勞森菌實(shí)時(shí)熒光RPA方法[6]，能夠有效快速的應(yīng)用于豬增生性腸炎的檢測(cè)，因此一種靈敏度高的檢測(cè)方法對(duì)于未來養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展是必要的。

隨著一些歐洲國(guó)家對(duì)抗菌藥物的限制使用，增生性腸炎已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要疾病之一[7]。中國(guó)作為養(yǎng)豬大國(guó)，雖然抗菌藥物對(duì)豬增生性腸炎的治療有作用，但抗菌藥物的頻繁使用會(huì)導(dǎo)致勞森菌產(chǎn)生耐藥性，因此提前完善養(yǎng)豬行業(yè)的管理措施和消毒措施、對(duì)養(yǎng)殖人員進(jìn)行知識(shí)培訓(xùn)、推動(dòng)疫苗和營(yíng)養(yǎng)添加劑的使用能夠有效地減少勞森菌對(duì)養(yǎng)豬行業(yè)的影響[8]。市場(chǎng)上使用的豬增生性腸炎菌苗有Intervet(荷蘭英特威)公司肌肉注射滅活苗和Oehringer Ingelheim(德國(guó)勃林格殷格翰)公司口服無毒活苗，能有效阻止其在宿主體內(nèi)引起病變，對(duì)于胞內(nèi)勞森菌的增殖有一定的抑制作用[9]。WHITNEY等研究表明飼料中添加含有可溶物和大豆皮的酒糟干[10]，能夠輕微的減輕胞內(nèi)勞森菌的感染。LEITE等研究表明飼料中鋅氨基酸復(fù)合物的添加也可以顯著減少由勞森菌引起的感染和損傷程度[11]。

胞內(nèi)勞森菌作為一種嚴(yán)重影響?zhàn)B殖效益的胞內(nèi)寄生菌，建立一套高效可行的檢測(cè)方法是非常必要的，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)胞內(nèi)勞森菌進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，準(zhǔn)確性高、檢測(cè)效率高，比常規(guī)檢測(cè)方法更具有優(yōu)勢(shì)，為今后該病的檢測(cè)診斷提供理論基礎(chǔ)。