吉安某豬場仔豬腹瀉的病原分析及防治

劉鳳飛，唐岳

（1.安福縣農業農村局，江西吉安343200；2.永新縣農業農村局）

仔豬腹瀉一直是造成養殖業經濟效益下降的多發性疾病，仔豬死亡率高且耐過豬生長發育受阻，并影響其肉質。仔豬腹瀉的病因多種多樣，可由各種細菌、寄生蟲、病毒引起，大多數規模化豬場雖然有合理的免疫及驅蟲程序，同樣也有優質的飼料供應，但仔豬腹瀉的情況仍然時有發生，這是多種致病因素綜合作用的結果[1]。因此對不同的豬場的仔豬腹瀉病例進行綜合分析，提出相應的防治措施并落到實處才能有效預防此類疾病的發生。

在生產實踐中，大腸桿菌感染引起的仔豬腹瀉十分常見且多發。大部分大腸桿菌是動物腸道的正常菌群之一，動物剛出生時機體并沒有大腸桿菌，需經過一段時間，經口進入動物消化道定居并可通過糞便長期排出體外，但也有部分特殊血清型的大腸桿菌具有致病性，對人及多種動物有較強的致病力[2]，如腸產毒素型大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌等。大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞的直桿菌，兩端鈍圓，大多菌株以周生鞭毛運動。可在普通培養基上生長良好，在麥康凱瓊脂培養基上形成紅色菌落，在伊紅美藍培養基（EMB培養基）上形成黑色帶金屬光澤的菌落，這是大腸桿菌區別于其他桿菌的標志性現象[3]。

本實驗在排除免疫失敗、寄生蟲、仔豬流行性腹瀉病毒等致仔豬腹瀉的病因后，用接種環刮取了病豬腸黏膜，接種于EMB培養基中，將培養基置于37℃恒溫生化培養箱中培養了24 h，結果在EMB培養基上觀察到了多量較單一的光滑型，黑色帶金屬光澤的菌落。繼而將菌落制備細菌涂片，干燥，染色，鏡檢為革蘭氏陰性球菌。因此高度懷疑某豬場仔菌腹瀉是由大腸桿菌感染引起。

近年來，國內養殖場濫用抗生素現象十分嚴重，導致大腸桿菌的耐藥譜不斷擴大，為有效選取該豬場大腸桿菌敏感的抗生素，最后進行了藥敏試驗。結果顯示該分離細菌對丁胺卡那（阿米卡星）敏感，對環丙沙星中度敏感，而對頭孢曲松、卡那霉素、新霉素、四環素、多西環素、紅霉素、氟苯尼考、阿奇霉素、林可霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑、氨芐西林鈉耐藥。臨床上應根據實際情況選取大腸桿菌敏感的藥物以達到良好的治療效果。并對豬場的管理進行評估，以尋找改善豬場環境衛生和飼養管理的方案以預防此類疾病再度發生。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 病料。病死仔豬采集小腸腸道；存活腹瀉仔豬，采集新鮮糞便；30份血樣：1～24號采自母豬，25～30號采自保育仔豬，每份2～3mL，保鮮保存。

1.1.2 試劑。培養皿、接種環、恒溫培養箱、顯微鏡、載玻片、伊紅美藍瓊脂培養基（EMB培養基）、藥敏紙片（丁胺卡那、環丙沙星、氨芐西林、頭孢曲松、卡那霉素、四環素、多西環素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑耐藥等抗菌藥敏紙片）、革蘭氏染液、生理鹽水。

1.1.3 相關設備。PCR儀、生化培養箱、高壓蒸汽滅菌器、顯微鏡、酶標儀等。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗體水平檢測。將送檢30份血樣，離心提取血清，采用ELISA法分別檢測其豬瘟抗體、豬偽狂犬gB抗體和gE抗體（野毒抗體）、藍耳病毒抗體、圓環2型病毒抗體，并記錄結果。其判斷標準如下：

（1）豬瘟抗體（阻斷ELISA法，美國IDEXX：99-43220-M301）判斷標準：阻斷率≥40%為合格（＋），阻斷率≤30%為不合格（－），阻斷率在30%～40%間為可疑（±）。

（2）豬偽狂犬（gB）總抗體（競爭ELISA法，美國IDEXX：09732-EP237）判斷標準：S/N值≤0.6為陽性（＋），S/N值≥0.7為陰性（－），S/N值在0.6～0.7之間為可疑（±）。

（3）豬偽狂犬（gE）野毒抗體（競爭ELISA法，美國IDEXX：09836-HP871）判斷標準：S/N值≤0.6為陽性（＋），S/N值＞0.7為陰性（－），S/N值在0.6～0.7之間為可疑（±）。

（4）藍耳抗體（間接ELISA法，美國IDEXX：40959-L481）判斷標準：S/P值≥0.4為陽性（＋），S/P值＜0.4為陰性（－）。

（5）豬圓環抗體（ELISA，深圳芬德：19007）判斷標準：OD值≥0.38為陽性，OD值在0.2～0.38之間為可疑（±），OD值＜0.2為陰性。

1.2.2 仔豬糞便球蟲檢測。采集病豬腸道內容物及糞便，采用飽和鹽水漂浮法，具體步驟如下：取5g豬腸道內容物及糞便放入盛有100mL生理鹽水的燒杯中，用玻璃棒順著同一個方向攪拌均勻后，用紗布過濾糞液到另一個燒杯中，棄去糞渣，水平靜置過濾液30min左右，然后用0.5cm的金屬圈水平接觸液面，提起后將采集到的濾液涂抹于載玻片上，壓上載玻片后鏡檢，并將鏡檢結果拍下記錄。

1.2.3 細菌分離。采集病豬腸道，無菌操作剪開腸管，于無菌生理鹽水中充分洗滌，用接種環刮取腸黏膜，劃線接種于EMB培養基。將培養基置37℃恒溫生化培養箱中培養24 h，觀察結果。

1.2.4 分離菌染色鏡檢。取少量生理鹽水滴于載玻片中央，接種環嚴格滅菌后冷卻一段時間，挑取培養24 h后的EMB培養基上光滑、邊緣整齊、黑色帶金屬光澤的單個菌落后，與載玻片上的生理鹽水均勻混合涂布成適當大小的薄層。運用革蘭氏染色法進行染色，其步驟如下：

(1)草酸銨結晶紫初染1min。

(2)將載玻片拿到水龍頭下，用較緩水流洗去浮色。

(3)用碘-碘化鉀溶液媒染1min，傾去多余溶液。

(4)乙醇(95%)脫色至無染液浮出為止。

(5)用沙黃復染30 s，傾去多余溶液。若是革蘭氏陽性菌則呈現藍色，若是革蘭氏陰性菌則呈現紅色。

1.2.5 藥物敏感試驗。采用藥敏紙片擴散法，用接種環挑取EMB培養基上的單個菌落懸于3mL生理鹽水中，混勻后與菌液比濁管比濁，調整濁度與比濁管相同。用無菌棉拭子蘸取菌液，擠掉多余菌液均勻涂布于整個瓊脂培養基表面，可反復操作至確認菌液全面均勻覆蓋瓊脂培養基。待培養基上的水分被瓊脂充分吸收后，用無菌鑷子夾起藥敏試紙，貼在培養皿表面，試紙一旦接觸到瓊脂表面就不可再次夾起，每個培養基貼7張藥敏紙片，各個紙片之間保持適當且一致的距離。將平板反轉放置于恒溫箱中，在適宜的溫度下培養24 h后取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄結果。（判斷標準見表1[5]

表1 藥敏試驗判斷標準

1.2.6 仔豬流行性腹瀉病毒基因檢測。采集病仔豬腸、脾臟等病料，運用RT-PCR的檢測方法，通過設計豬流行性腹瀉病毒的特異性檢測引物，提取病料中的總RNA，在50℃30min;95℃5 min;95℃40～60 s，55℃40～90 s，72℃1～5.5 min的條件下，循環35次;再在72℃的溫度下延伸10 min，對提取到的基因組進行RT-PCR擴增，然后取出5μL擴增產物，加1μL 6×上樣緩沖液，10 g/L瓊脂糖凝膠、120 V電壓45 min，電泳檢測，通過紫外凝膠成像系統觀察擴增片段[4]。

2 結果與分析

2.1 抗體水平檢測結果。送檢30份血樣抗體水平檢測結果見下表2。

檢測結果顯示：豬瘟抗體合格率93.33%、平均阻斷率73.27%、離散度25.57%；偽狂總抗體合格率100%，偽狂野毒抗體陽性率為0，可疑6.67%；藍耳抗體陽性率93.33%、離散度46.81%、其中有16頭S/P值≥2.5；豬圓環抗體陽性率76.67%、離散度51.27%。

表2 血樣抗體水平檢測結果

說明：豬群豬瘟抗體水平較好；偽狂犬總抗體水平高、未檢出偽狂野毒抗體，但有2頭可疑；藍耳病毒抗體水平高、整齊度一般；圓環2型病毒抗體一般。

2.2 仔豬糞便球蟲檢測結果

樣品1（如圖1）和樣品2（圖2）均未發現球蟲等腸道寄生蟲蟲卵及卵囊，球蟲檢測陰性（-）。

圖1、圖2 糞便樣品寄生蟲檢測結果

2.3 細菌分離鑒定結果

培養結果如圖3和圖4，可見EMB培養基上，有多量較單一的光滑型，黑色帶金屬光澤菌落。

菌落制備細菌涂片，干燥，染色，鏡檢為革蘭氏陰性球桿菌（圖5、圖6），可疑大腸桿菌。

圖3、圖4 細菌分離結果

2.4 藥物敏感試驗結果

培養結果如圖7。該分離細菌對丁胺卡那（阿米卡星）敏感，對環丙沙星中度敏感，對頭孢曲松、卡那霉素、氨芐西林、新霉素、四環素、多西環素、氟苯尼考、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素、復方新諾明、磺胺異惡唑耐藥。藥敏試驗結果見表3。

圖5、圖6 細菌染色鏡檢結果

圖7 細菌藥敏試驗結果

表3 藥敏試驗結果判斷 mm

2.5 病毒基因檢測結果

送檢2個樣品，經RT-PCR擴增，均未擴增出特異性病毒基因片段（見圖8），豬流行性腹瀉病毒檢測陰性（-）。

3 分析與討論

腸產毒型大腸桿菌是引起豬場仔豬腹瀉主要的病原微生物之一，常使仔豬發育遲緩，生產性能降低，嚴重的可導致死亡，給養殖場造成很大的經濟損失。初生仔豬與早期斷奶仔豬免疫系統尚未發育完全或斷奶導致的免疫抑制等造成仔豬對大腸桿菌的敏感性增高，抵抗力下降，從而引發大腸桿菌性腹瀉[6]。

3.1 關于病因的討論

根據采集到的30份血樣進行了抗原抗體檢測，結果顯示：豬群豬瘟抗體水平較好；偽狂犬總抗體水平高、未檢出偽狂野毒抗體，但有2頭可疑；藍耳抗體水平高、整齊度一般；圓環病毒抗體一般。說明該豬場比較注重病毒性傳染病的免疫，但是卻忽視了豬群中細菌性傳染病的預防。該豬場仔豬發病時間在三月，正值低溫高濕的季節，若不采取豬場的保溫措施，仔豬的自身抵抗力將下降，腸道內的致病性大腸桿菌往往會大量繁殖，引發大腸桿菌病[7]。

圖8 病毒基因擴增結果

3.2 關于大腸桿菌的致病機理的討論

腸產毒型大腸桿菌可通過口腔進入易感宿主小腸，其菌毛黏附素與小腸上皮細胞的微絨毛和細胞表面的受體相結合，從而在腸內定居繁殖，同時產生并釋放腸毒素，對仔豬腸道內靶細胞產生毒性作用。其中不耐熱腸毒素（LT)可活化胞內腺苷酸環化酶，導致cAMP濃度升高，耐熱腸毒素（ST)可激活腸黏膜上皮細胞內的鳥苷酸環化酶，使胞內cGMP濃度升高，引起一系列級聯激活反應，最終使Cl-和HCO3-大量分泌，而Na+的吸收受到抑制，腸內水和電解質大量蓄積而使滲透壓升高，進而引起水樣腹瀉[8]。

3.3 關于治療方面的討論

根據實驗室檢測結果可以初步確定是大腸桿菌性腹瀉，再結合藥敏試驗結果，應采取以下治療措施。

3.3.1 打掃豬舍并消毒。清理豬舍中殘留的糞便，并使用環境消毒劑對豬舍進行全面的消毒。保持豬體干燥潔凈，必要時可用干燥消毒粉帶豬消毒，給豬群營造衛生的生長環境。

3.3.2 抗生素治療。輕度腹瀉的仔豬可早晚按體重口服環丙沙星口服液，連用3d，觀察治療效果。重度腹瀉仔豬肌肉早晚按體重注射阿米卡星，連用3d，觀察治療效果。

3.3.3 對癥治療。對脫水的仔豬采取補液治療：輕度脫水可早晚按體重口服氨基酸維生素，在仔豬的飲水中添加補液鹽，連用2～3d。中度脫水可早晚按體重在病豬腹腔豬舍10%葡萄糖生理鹽水[9]。

3.4 關于預防方面的討論。

致病性大腸桿菌除了可以通過糞便、被污染的飼料和飲水侵襲仔豬外，還可通過帶菌母豬的胎盤和乳汁傳染給仔豬，所以做好懷孕母豬的保健和環境消毒十分重要。應改善母豬的飼料質量，使母豬膘情良好。臨產前一個月接種大腸桿菌k88、k99進行免疫[10]。在轉入分娩舍前5天，母豬應做好清潔和全面消毒的工作。轉入分娩舍后應清洗消毒欄舍，避免產房污染。母豬在生產時先用0.1%高錳酸鉀溶液擦拭乳房、會陰等部位，同時擠去可能受到污染的乳汁3～4滴[8]，切斷母豬將致病性大腸桿菌傳給仔豬的途徑。

在飼養管理方面，在仔豬出生后應保持欄舍中的衛生，定期消毒，并注意仔豬的保暖，防止仔豬因寒冷而導致自身免疫力下降。對斷奶仔豬，要盡量減少諸如寒冷、環境、混群、運輸等造成的應激。此外還需定期對豬群進行全面的檢疫，淘汰、隔離患病豬，以控制不同血清型的大腸桿菌進入豬群。關注哺乳母豬的泌乳情況，定期抽檢乳汁，對泌乳少的母豬，應增加其飼喂次數或改善飼料水平。淘汰因種用時間長而產弱仔、泌乳少的母豬。

在豬群免疫方面，應注意注射疫苗時杜絕多頭豬共用一個針頭注射的情況。初生仔豬需在出生后4 h之內飼喂初乳，增加其體內的抗體水平，增強其免疫力[11]。

4 小結

仔豬腹瀉的病例在養殖場中發病率較高，是危害養殖業的一類可由多種因素綜合作用造成的疾病。本文主要針對吉安某豬場發生的仔豬腹瀉病例，進行了一系列的實驗室診斷措施，尋找其發病原因并結合藥敏試驗結果提出相應的治療和預防措施，以期能降低該養殖場的仔豬腹瀉的發病率并為其他養殖場提供相應的參考。