響應面法優化亞臨界水提取火龍果莖多糖

李國勝，黃秀銀，白新鵬

（海南大學食品科學與工程學院/熱帶多糖資源利用教育部工程研究中心，海南 海口 570228）

0 引言

【研究意義】火龍果（Pitaya）又名仙蜜果，屬仙人掌科，原產于中美洲熱帶沙漠地區，目前在廣東、廣西、云南、貴州、海南等省大規模種植[1?2]。火龍果莖中含有植物性多糖、VE、多種礦物質元素和甾醇等物質[3]。在火龍果栽培過程中，果農要不斷修剪分枝，只需要保留1條主莖，不僅可以提高果實的產量和品質，還可以方便果實采摘運輸，但由此產生大量修剪下來的火龍果枝條，又因為這些枝條在目前除了少量用于栽種，大部分的枝條都還沒有得到合理的開發和利用，所以對火龍果莖多糖進行提取利用，可以提高火龍果種植的附加值。【前人研究進展】馬若影等[4]對亞臨界水提取火龍果莖多糖的工藝進行研究，通過單因素和正交試驗得到最佳工藝參數為：溫度140 ℃，時間25 min，液料比50∶1。徐曼旭等[5]研究薏米多糖亞臨界水萃取發現亞臨界水提取多糖得率和提取時間比水浸法有優勢。包怡紅等[6]提出壓力為1.0 MPa，多糖提取率達到最高。劉煥燕等[7]通過試驗證實了壓力的主要作用是用來保持水的液體狀態，它的變化對水的極性影響較小，所以對提取效果的影響不明顯。據報道，部分多糖在稀酸條件下對其提取有一定的優勢，能使多糖的提取率有所提高，然而酸性環境并不能夠適合所有的多糖，只能針對某些植物多糖的提取。因為多糖中的糖苷鍵在酸性環境中會發生斷裂，因此在試驗中要求對多糖提取酸堿度的把控要精準。【本研究切入點】亞臨界水適于萃取各種難萃取的天然產物和各種固體樣品中的被測物，通過控制溫度和壓力還可以測定揮發性較強的物質和強極性物質[8?10],但目前關于亞臨界水提取火龍果莖多糖的研究少見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究采用亞臨界水提取火龍果莖多糖 ，并使用響應面法對試驗數據進行優化，為后續火龍果莖多糖開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試原料由海南省東方市北緯十八度果業有限公司提供。主要試劑：葡萄糖、濃硫酸、苯酚、鹽酸，購于廣州化學試劑廠；氫氧化鈉、無水乙醇，購于西隴科學股份有限公司。以上試劑均為分析純。主要儀器設備及來源：FDU-2100冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；中草藥粉碎機（FW-177），天津市泰斯特儀器有限公司；離心機（GL-20G-Ⅱ），上海安亭科學儀器廠；HT-250FC亞臨界水提取裝置，上海霍桐實驗儀器有限公司；752-N可見紫外分光光度計，上海精密儀器科學有限公司；EV-321旋轉薄膜蒸發儀，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；KQ-800KDE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預處理 稱取清洗干凈的紅心火龍果莖1 200 g，將紅心火龍果莖切成小塊后放入培養皿中，在凍干機里冷凍干燥72 h后，將干燥后的火龍果莖粉碎，過42 目篩。取過篩后的固體粉末按10∶1的液料比（mL·g?1） 加蒸餾水，并將配好后的樣品調節至合適的酸堿度，在250 W的超聲頻率下處 理30 min備用[11?12]。

1.2.2 工藝流程 （1）工藝流程：火龍果莖凍干粉→過篩→調節pH→亞臨界水提取→離心→上清液→濃縮→乙醇沉淀→靜置→離心→冷凍干燥→火龍果莖多糖。（2）操作要點： 預處理后的樣品，按所需料液比加蒸餾水，置于亞臨界水提取裝置中，按著設定的液料比、溫度、pH值和提取時間，對其進行提取，提取結束后以8 000 r·min?1離心10 min，取上清液，旋轉蒸發儀濃縮，加入無水乙醇至體積分數為80%，經充分攪拌后，于4 ℃下 靜置12 h，再在8 000 r·min?1條件下離心5 min，取沉淀冷凍干燥得火 龍果莖多糖。

1.2.3 葡萄糖標準曲線的建立 采用史偉國等[13]的方法，稱葡萄糖粉末10 mg用蒸餾水溶解，定容至100 mL，得到0.1 mg·mL?1葡萄糖標準液。標準液按梯度濃度測吸光度，用Excel做出圖表，橫坐標為葡萄糖濃度C，縱坐標為490 nm處吸光度A，根據所測得數據繪制出標準曲線。得標曲方程為Y=47.72X+0 .008 2，相關系數為 0.994 1。

1.2.4 多糖的測定 稱取火龍果莖多糖5 mg，定容至50 mL，得0.1 mg·mL?1的溶液，再根據1.2.3的方法測定火龍果莖粗多糖的吸光度，利用葡萄糖標準曲線由吸光度算出火龍果莖多糖含量C。

式中：Y為火龍果莖多糖提取率，%；C為火龍果莖多糖含量，mg·mL?1；V為提取液體積，mL；W 為火龍果莖粉質量，mg。

1.2.5 提取火龍果莖多糖的單因素試驗 亞臨界水萃取的影響因素[14]包括溫度、液料比、時間、改良劑及壓力。根據Bin Li等[15]研究結果表明亞臨界水萃取中萃取溫度對萃取效率影響最大，趙健等[16]研究表明亞臨界水萃取時間也是重要的因素之一，本試驗在液料比為30∶1，提取時間為20 min，pH為5，溫度為140 ℃時，控制變量讓溫度以20 ℃ 為梯度從100 ℃增加至180 ℃；時間以5 min為梯度從10 min增加至30 min；液料比 （mL·g?1）以10為梯度從20∶1增加至60∶1 ；pH值以1為梯度從4增至8 提取。

1.2.6 響應面分析試驗 根據單因素探究的數據，用Design Expert 10.0軟件對提取溫度（A）、時間（B）、液料比（C）、pH值（D）等4因素的3個水平用Box-Behnken設計試驗，以多糖提取率為響應值 優化火龍莖多糖的提取工藝，因素水平見表1。

1.3 數據處理

單因素研究中的數據選用Excel軟件做出折線圖，采用Design Expert 10.0軟件對數據進行分析。

表 1 響應面分析試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

圖 1 溫度對多糖提取率的影響Fig. 1 Effect of temperature on polysaccharide extraction

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對火龍果莖多糖提取率的影響 如圖1所示，100～140 ℃，溫度與多糖的提取率成正比，至140 ℃時提取率達到21.45%，然而在140 ℃出現拐點，此溫度以后，火龍果莖多糖的提取率和溫度呈反比例的關系，因為在溫度過高的條件下火龍果莖多糖糊化。溫度過低，隨著溫度升高，水的介電常數、黏度、表面張力明顯下降，分子的擴散速率有所增加[17]。140～160 ℃階段趨于平衡，但是考慮到高溫導致多糖糊化的因素，選擇提取溫度1 36～160 ℃ 比較合適。

2.1.2 提取時間對火龍果莖多糖提取率的影響 根據圖2可知，從提取時間為10 min開始，多糖的提取率也隨之增加，當時間達到15 min時，提取率達到最大。但隨著提取時間的增加，在15 min以后的提取率先是逐漸下滑后又處于平緩。以13～20 min的提 取時間較為合適。

2.1.3 液料比對火龍果莖多糖提取率的影響 試驗結 果 圖3可 看 出，從20∶1（mL·g?1） 的 液 料 比 開始，加水量的增加對多糖的提取率產生有利的影響使得提取率與液料比正相關，直到加水至液料比達30∶1（mL·g?1） 時多糖的提取率相對高。然而在30∶1（mL·g?1） 后，隨著液料比升高多糖的提取率下跌。液料比過低的條件下多糖不能完全被溶解從而對提取率產生不利影響，反之加水量過多不僅會降低濃度，同時也會造成難以濃縮。所以選擇液料比為30∶1（mL·g?1） 左右較為適宜。

圖 2 時間對多糖提取率的影響Fig. 2 Effect of time on polysaccharide extraction

圖 3 液料比對多糖提取率的影響Fig. 3 Effect of Liquid-to-material ratio on polysaccharide extraction

2.1.4 pH對火龍果莖多糖提取率的影響 由圖4可看出，pH在4～8時多糖提取率先升后降，pH 值5時多糖提取率出現了拐點，此時的提取率為21.45%。在pH值5以后，提取率開始呈現出下降的趨勢。因為過酸過堿的條件都會導致多糖的水解，所以選擇p H值5為最適條件。

2.2 響應面優化提取的結果及分析

2.2.1 回歸模型的建立 響應面試驗設計及結果如表2所示，以多糖提取率（Y）為響應值，經過多元回歸擬合，得到回歸方程：Y（%）=21.954.54A?2.86B?2.69C+0.44D?1.76AB+1.36AC?0.73AD+0.29BC+0 .29BD+0.14CD?3.34A2?2.24B2?0.60C2?0.72D2。

圖 4 pH對多糖提取率的影響Fig. 4 Effect of p H on polysaccharide extraction

2.2.2 顯著性檢驗 由表3可看出模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），方程的相關系數為 0.902 3，則方程擬合度較好，可用得出的回歸方程描述各個因素與多糖提取率的關系，對火龍果莖多糖提取率進行預測。由表中各個因素的P值可得出溫度、時間、液料比3個因素對火龍果莖多糖提取率影響極顯著，pH因素對多糖提取率影響不顯著。在所選的因素條件范圍內，由F值可知，對火龍果莖多糖提取率的影響程度順序為：溫度＞時間＞液料比＞pH。

表 2 響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

表 3 回歸模型方差分析結果Table 3 Analysis of variance for fitted regression model

2.2.3 不同因素間的響應面分析 圖5顯示了提取溫度（A）、提取時間（B）、液料比（C）、pH值（D）4個因素對火龍果莖多糖提取率的3D 響應面圖和等高線圖。響應曲面圖中曲面反映了各因素對響應值的影響大小，響應曲面越陡峭，則表示該因素對響應值影響較大，反之則較小[18]。圖中響應面趨勢較為陡峭，表明提取溫度、提取時間、液料比的影響具有顯著性，但pH值及各因素的交互作用不明顯，響應面趨勢較為平緩，交互作用不顯著。

2.3 驗證試驗

為了驗證響應面法分析所得到的結果是否可靠，用Design-Expert軟件優化回歸模型進行的工藝參數，確定亞臨界水提取多糖的工藝條件為：液料比31.25∶1（mL·g?1） 、pH值 5.86、溫度143.64 ℃、時間19.04 min時，預測火龍果莖多糖提取率為26.528%。在優化條件下做3 次平行試驗驗證火龍果莖多糖提取率為26.46%，驗證試驗所得到的數據和響應面法預測得到的數據是相近的，說明該回歸模型很好地反應各因素對多糖提取率的影響，證明使用該方法來研究亞臨界水萃取火龍果莖多糖的工藝是可行的。

圖 5 各因素交互作用的響應面圖Fig. 5 Response plot of interactions between factors

3 討論與結論

多糖的提取通常采用熱水提醇沉法、超聲波提取法、微波輔助提取法、生物酶解提取法和堿法提取，每種提取方法具有各自的優勢，但也存在一些缺點，比如熱水提醇沉法提取率低、耗時長，堿法提取溶劑的用量較大、同時產生一定的環境污染，生物酶解提取法提取成本較大，較難工業化生產。亞臨界水提取技術提取范圍廣、提取效率高，是一項綠色、環保的新興提取分離技術。目前采用亞臨界水提取技術提取火龍果莖多糖的相關研究鮮有報道。因此，本研究通過單因素的探究提供的依據下，選取多糖提取率為響應值，采用響應面法分析優化亞臨界水提取火龍果莖多糖的工藝條件，得出最佳提取工藝為：提取溫度144 ℃、提取時間19 min、液料比 （mL·g?1） 31∶1，pH值5.9，在優化條件下火龍果莖多糖提取率是26.47%。此外，本研究多糖含量采用苯酚-硫酸法測定，使用的標準品是葡萄糖，但李丹丹[19]指出植物多糖水解后的單糖成分有鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和半乳糖醛酸等成分，所以測出來的吸光度就只是葡萄糖的數據，其他的糖分則測不出來，如果能采用各種糖并且按照合理比例配成標準液，試驗結果將更加準確。

通過響應面法優化的火龍果莖多糖提取工藝模型具有較高的可行性，優化后的工藝條件可提高火龍果莖多糖提取率。