本氏煙中與番茄斑萎病毒N蛋白互作的寄主因子的篩選

苗淑月，高曉曉，鄭立敏，陳建斌，趙星月，程菊娥，陳 莎，章松柏 ，劉 勇

（1. 長江大學農學院，湖北 荊州 434025；2. 湖南省農業科學院植物保護研究所，湖南 長沙 410125；3. 西南林業大學，云南 昆明 650032；4. 湖南工業大學生命科學與化學學院，湖南 株洲 412007）

0 引言

【研究意義】番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是布尼亞病毒目（Bunyaviriales）、番茄斑萎病毒科（Tospoviridae），正番茄斑萎病毒屬（Orthotospovirus）的成員[1]。該病毒是農業生產的重要病原物之一，其寄主范圍十分廣泛，包括番茄、辣椒等蔬菜作物以及花卉等經濟作物[2]。TSWV已被列為全球十大植物病毒之一，每年造成的損失超過10億美元[3?4]。目前，TSWV已經在荷蘭、法國、英格蘭、意大利以及西班牙等歐洲國家暴發，隨后傳播到南、北美洲等地。近年來，在伊朗、日本、韓國、中國等亞洲國家陸續發現該病毒[5?8]。自TSWV首次在我國發現以來，因其病害擴展迅速，目前在天津、北京、山東、海南、云南等多地均有報道。明確寄主蛋白調控N蛋白多聚體的形成過程及N蛋白介導的病毒致病機理，有助于了解寄主因子調控TSWV在煙草內侵染的分子機制，解析病毒侵染機理。【前人研究進展】番茄斑萎病毒的病毒粒體為球狀體或多面體顆粒，病毒顆粒直徑大約有80～120 nm[9]。其基因組為三分體RNA單鏈，根據其分子量命名為L RNA，M RNA和S RNA[10]。L RNA的互補鏈編碼RdRp蛋白，M RNA編碼Gn/Gc蛋白和非結構蛋白（NSm），S RNA編碼核衣殼蛋白（N）和非結構蛋白（NSs）[11?12]。所有蛋白質以高度協調的方式在寄主細胞內發揮作用，有助于TSWV成功感染寄主植物。番茄斑萎病毒的核衣殼蛋白（N）可以自身結合形成多聚體并與核糖核蛋白（RNPs）的形成有關[13?14]。在植物體內病毒粒子的裝配和成熟與N蛋白與Gn和Gc蛋白的互作有關[15]。此外，病毒通過胞間連絲的過程需要NSm和N之間的相互作用來完成[16]。近年來，對N的晶體結構進行研究，發現N具有一個由帶正電荷的N-和C-端組成的結構域，并且有一個潛在的RNA結合位點。此外，N的結構域介導與相鄰亞單位的同型蛋白之間的相互作用[12]。TSWV N在植物細胞內可以形成沿著內質網和微絲組成的網絡高速運動的顆粒[17]。在TSWV侵染寄主植物時，發現N蛋白與誘導超敏感型辣椒的程序性細胞死亡（PCD）有關[18]。研究表明，含有綠色熒光蛋白（GFP）基因與TSWV的N基因融合片段的轉基因植株表現GFP和N基因片段的轉錄后基因沉默，并且對TSWV具有抗性[19]?！颈狙芯壳腥朦c】TSWV N蛋白在介導病毒侵染寄主過程中發揮著至關重要的作用。本試驗以TSWV N蛋白作為誘餌蛋白，采用酵母雙雜交（Yeast two-hybrid，Y2H）的方法篩選煙草內與TSWV N相互作用的寄主蛋白?！緮M解決的關鍵問題】研究結果有助于了解寄主蛋白調控N蛋白多聚體的形成過程及N蛋白介導的病毒致病機理，以及寄主因子調控TSWV在煙草內侵染的分子機制和病毒侵染機理，解析病毒侵染機理，以期為后續更有效地防控該病毒病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

pGBKT7-N、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam、pGADT7-T等重組質粒、煙草酵母文庫，酵母菌株Y2H Gold、大腸桿菌菌株（Escherichia coli）DH5α由湖南省植物保護研究所實驗室保存；酵母雙雜交營養缺陷型培養基，X-α-gal、Aureobasidin A購自寶生物工程（大連）有限公司；酵母質粒提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；一步法酵母活性蛋白提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；cMyc的單克隆抗體購自Thermo Fisher Scientific。

1.2 試驗方法

1.2.1 重組誘餌載體pGBKT7-N的自激活檢測 采用醋酸鋰轉化法將誘餌表達載體質粒pGBKT7-N和pGADT7、陽性載體質粒pGBKT7-53和pGADT7-T、陰性載體質粒pGBKT7-Lam和pGADT7-T分別轉化入Y2H Gold酵母感受態細胞，涂布于SD/-Trp/-Leu營養缺陷型培養基，并在30 ℃恒溫倒置培養2-3 d，待克隆長出后挑取單克隆劃線于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal營養缺陷型培養基，在30 ℃恒溫倒置培養2-3 d，比較酵母菌落的生長狀態 和顏色變化，判斷N蛋白是否有自激活活性。

1.2.2 重組誘餌載體pGBKT7-N的毒性檢測 采用醋酸鋰轉化法將誘餌表達載體質粒pGBKT7-N轉入Y2H Gold酵母感受態細胞，同時轉化pGBKT7空載體做對照，將轉化好的酵母菌分別稀釋10倍、100倍、1 000倍，然后取100 μL涂板于SD/-Trp營養缺陷型培養基。30 ℃恒溫倒置培養2～3 d，直至長出克隆。比較單克隆的大小和數量，判斷N蛋白對酵母 細胞是否有毒性。

1.2.3 Western blotting檢測TSWV N蛋白在酵母細胞內的表達 在30 ℃ 250 r·min?1條件下，用SD/-Trp液體培養基培養1.2.2獲得的pGBKT7-N單克隆酵母菌至OD600大于1.0，1 000 g離心10 min收集菌體，提取酵母總蛋白，用cMyc的單克隆抗體來檢測N蛋白 是否在酵母Y2H Gold細胞內表達。

1.2.4 重組誘餌載體pGBKT7-N篩選煙草文庫 在轉有誘餌表達載體pGBKT7-N的SD/-Trp固體培養基上挑取單克隆于50 mL SD/-Trp液體培養基中。在30 ℃250 r·min?1條件下，振蕩培養直到OD值為0.8左右。然后將其離心后與轉有煙草cDNA文庫的菌株Y187進行融合培養，培養20 h左右取出培養液，在顯微鏡下觀察到有接合體出現時繼續培養4 h，離心并洗脫后涂布于15 cm SD/-Trp/-Leu/-His營養缺陷型培養基上，挑取單克隆，轉移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba、SD/-Trp/-Leu/-His/-A de/Aba/X-ɑ-gal營養缺陷型培養基上進行顯色反應。

1.2.5 酵母質粒提取及PCR鑒定測序分析 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養基在30 ℃ 250 r·min?1條件下震蕩培養從SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養缺陷型培養基上挑取的長勢良好的酵母菌2 d后提取酵母質粒，用pGADT7載體的通用引物對質粒進行PCR擴增鑒定。PCR反應體系：酵母質粒1 μL，10 μmol·L?1上下游引物各0.5 μL，反應緩沖液2.5 μL，dNTPs（2.5 mmol·L?1）2 μL，TransStart?Top Taq DNA聚合酶（2.5 U·μL?1）0.5 μL，去離子水18 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸120 s，共30個循環后，72 ℃延伸7 min。并將提取到的質粒轉化至E. coli DH5ɑ內，以3′AD為引物進行菌落PCR擴增鑒定，提取捕獲質粒并進行測序。分析篩選到的互作基因名稱、基因 簡介、讀碼框完整性和一致性等信息。

2 結果與分析

2.1 酵母誘餌表達載體自激活檢測

分別將誘餌載體pGBKT7-N和空載體pGBKT7、陽性載體pGBKT7-53和pGADT7-T、陰性載體pGBKT7-Lam和pGADT7-T轉入酵母菌株Y2H Gold中，比較其在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-ɑ-gal營養缺陷型培養基上的生長情況，發現三組質粒在SD/-Trp/-Leu營養缺陷型培養基上均能生長（圖1-a）。只有pGBKT7-53和pGADT7-T在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade營養缺陷型培養基上生長（圖1-b）并在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-ɑ-gal營養缺陷型上顯藍色（圖1-c），試驗結果證明誘餌載體pGBKT7-N不能單獨激活報告基因表達 ，沒有自激活現象。

2.2 酵母誘餌表達載體的毒性檢測

將誘餌載體pGBKT7-N和空載體pGBKT7轉入酵母菌株Y2H Gold中，比較其在SD/-Trp營養缺陷型培養基上的生長情況，發現兩組菌落大小均隨著稀釋倍數的增加而變大，數量均隨著稀釋倍數的增加而變少，且兩組菌落大小均勻一致，表明N蛋白表達對Y2H Gold酵母菌無毒性。

圖 1 N蛋白在酵母細胞中的自激活驗證Fig. 1 Verification of self-activation of N protein in yeast cells

2.3 誘餌表達載體在酵母細胞內的表達

以含pGBKT7空載體的菌落作為陰性對照，用SD/-Trp液體培養基震蕩培養含有誘餌表達載體pGBKT7-N的單菌落，利用一步法酵母活性蛋白提取試劑盒提取酵母總蛋白。由于載體上的標簽cMyc與誘餌可形成融合蛋白，因此本試驗以cMyc的單克隆抗體進行Western-blotting檢測，結果表明N蛋白能夠在酵母細胞中表達，N與cMyc的融合蛋白大小為39 kDa（ 圖2）。

2.4 篩選與TSWV N蛋白互作的寄主蛋白

將轉入誘餌質粒pGBKT7-N的菌株Y2H Gold過夜培養至OD值為0.8左右，然后將其離心后與轉有煙草cDNA文庫的菌株Y187進行融合培養，20 h后取出培養液，在顯微鏡下觀察到有形狀像米奇頭像或三葉草形狀的接合體出現（圖3），繼續培養4 h后離心并洗脫，涂布于15 cm SD/-Trp/-Leu/-His營養缺陷型培養基上，挑取單克隆，轉移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade /Aba、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/Aba/X-ɑ-gal營養缺陷型培養基上，并在3～5 d后發現有114菌落生長并發生顯色反應（圖4）。

2.5 鑒定與TSWV N蛋白互作的寄主蛋白

挑取114個菌落，經SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液體培養基培養2 d，提取酵母質粒，并進行質粒PCR檢測（圖5），選取條帶大于500 bp的質粒轉化E.coliDH5ɑ，以氨芐青霉素為抗生素進行陽性篩選，挑取陽性克隆送公司測序，分析后共發現15種蛋白，將序列在NCBI比對發現這15個蛋白分別為葉綠素ab結合蛋白16（chlorophyll a-b binding protein 16, CabBP16）、葉綠素a-b結合蛋白（chlorophyll a-b binding protein, Ca-bBP）、葉綠素a-b結合蛋白50（chlorophyll a-b binding protein 50, Ca-bBP50）、葉綠素a-b結合蛋白CP 26（chlorophyll a-b binding protein CP 26, Ca-bBp CP 26）、1，5二磷酸核酮糖羧化加氧酶小鏈（ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase small chain Rubisco，1,5-BCOSC）、葉綠素a-b結合蛋白21（chlorophyll a-b binding protein 21, Ca-Bbp 21）、30S核糖體蛋白S6（30S ribosomal protein S6 alpha,30SRPS6A）、光系統I反應中心亞基II（photosystem I reaction center subunit II, PIRCSII）、酰基輔酶A結合蛋白（acyl-coa-binding protein, ACBP）、脂質轉移蛋白（lipid transfer protein, LTP）、非特異性脂轉移蛋 白 2（non-specific lipid-transfer protein 2-like,NSLTP2L）、多蛋白橋接因子1b（multiprotein-bridging factor 1b-like, MBF1BL）、衰減核糖體生物發生蛋白BRX1同源物（ribosome biogenesis protein BRX1 homolog, RBPBRX1H）、細胞分裂周期蛋白48同源物（cell division cycle protein 48 homolog, CDCP48H）、硫胺噻唑合酶（thiamine thiazole synthase, TTSCL）（表1）。

圖 2 Western blot檢測N蛋白在酵母內的表達情況Fig. 2 Expression of N protein in yeast as detected by Western blot

圖 3 酵母結合體Fig. 3 Yeast complexes

圖 4 酵母菌在四缺培養基上的生長情況Fig. 4 Growth of yeast on 4 nutrient-deficient culture media

圖 5 陽性克隆的PCR檢測Fig. 5 PCR detection of positive clones

表 1 與TSWV N蛋白互作的15個候選蛋白Table 1 Fifteen candidate proteins that interacted with N protein of TSWV

3 討論

目前，尚未有治療TSWV的有效手段。隨著科研工作者對TSWV的深入研究，對該病害的病狀、發病規律的了解越來越多。然而，對于TSWV與寄主植物的互作關系了解的相對較少。盡管培育抗TSWV的植物是防治TSWV的必由之路，過去幾十年的研究讓我們對TSWV致病性以及番茄對該病毒的抵抗力的理解有了質的飛躍，但是，這種抗性是特異性的，并且很快被病毒所克服，因此不能成功地用于育種工作。而研究TSWV與寄主的互作關系也同樣可以指導番茄等作物的生產，并可以為TSWV防控提供有效理論依據。N蛋白在植物寄主的主要作用也與病毒的增殖密切相關。因此，為了更好地研究寄主和TSWV的相互作用，尤其是了解寄主蛋白參與調控病毒的增殖過程，使植物成功獲毒，本試驗以N蛋白為誘餌蛋白篩選煙草酵母文庫，為更好開展TSWV與寄主的互作研究奠定基礎，為找到阻斷病毒在植物體內增殖尋找理想靶標，為防治病毒提供新的思路和方向。

本研究在對酵母菌誘餌載體進行表達后發現其融合蛋白大小為39 kDa，較目標融合蛋白偏小，可能是當cMyc標簽蛋白存在時，誘餌蛋白的mRNA轉錄量減少所導致的[20]。另外，本研究共篩選到15個寄主蛋白與TSWV N互作。分別為Ca-bBP、Ca-bBP 16、Ca-Bbp 21、Ca-bBP 50、Ca-bBp CP 26、1,5-BCOSC、30SRPS6A、PIRCSII、ACBP、LTP、NSLTP2L、MBF1BL、RBPBRX1H、CDCP48H、TTSCL蛋白（表1）。其中Ca-bBP、Ca-bBP 16、Ca-Bbp 21、Ca-bBP 50是葉綠體結合相關蛋白，可能參與色素的生物合成或類囊體膜的組裝[21]。Ca-bBp CP 26是葉綠體結合相關蛋白，屬于Lhc蛋白家族，在CP 26中，3個葉綠素結合位點對Chl-a有選擇性，第一個是色素蛋白復合物折疊所必需的；第二個是蛋白質折疊所必需的，并可以與葉黃素特異性結合；第三個具有較低的選擇性，可以與類囊體中存在的任何葉黃素物種結合[22]。1,5-BCOS與核酮糖二磷酸羧化酶相關，是自然界中含量最豐富的蛋白質，可能會對催化蔬菜核酮糖二磷酸羧化酶的遲滯性、時間依賴性的活性降低產生不同的影響[23]。核酮糖二磷酸羧化酶在植物中含量豐富，大約占總葉綠蛋白的一半。葉綠素含量的高低往往能客觀反映植物抗病性的強弱[24]。葉綠體作為植物特有的光合作用的細胞器，通過將信息傳遞至細胞核來調節抗病基因表達，從而激活防御來抵御入侵者。N蛋白可能“模仿”植物自身的蛋白質行為，到達葉綠體，通過損害葉綠體與細胞核之間的通訊來阻礙植物防御反應的激活，促進自身的生存和繁殖。本研究中N蛋白與葉綠體相關蛋白互作的研究為設計植物保護策略與開發新的抗病品種提供了新思路。30SRPS6A是參與翻譯調控的輔助蛋白[25]。RBPBRX1H參與核糖體生物發生的過程，核糖體成熟過程中核糖體蛋白的rRNA加工和組裝涉及許多核糖體生物發生因子，與核糖體的成熟相關[26]。寄主細胞的核糖體蛋為病毒基因組復制和蛋白翻譯所需的各種蛋白組分。推測其可能通過與TSWV N發生相互作用而促進病毒蛋白在植物體內的翻譯。PIRCSII以體內亞基II的前體作為PSI復合物的一部分被插入和嵌入到類囊體中，然后通過基質肽酶的作用被加工成成熟的形式[27]。ACBP在脂質代謝和細胞功能調節中發揮重要作用[28]。可能被N結合和運輸，從而提高植物的抗逆性。LTP是致病性相關蛋白（PR-14）家族的成員，參與植物防御反應[29]。NSLTP2L在植物發育和對非生物脅迫的反應中發揮著重要作用[30]。脂質轉移蛋白可能通過與N的相互作用來參與植物的生理功能，進一步促進植物細胞壁的延伸，增強植物自身對細菌和真菌病原體的防御活性。MBF1BL可以增強擬南芥的耐鹽性和對ABA不敏感性。在鹽和ABA條件下，脅迫響應基因的轉錄水平顯著提高。多蛋白橋接因子1（MBF1）是一種轉錄輔助激活因子，通過連接序列特異性激活因子樣蛋白和TATA-box結合蛋白（TBP）介導轉錄激活[31]。MBF1BL在植物種可能通過與N的相互作用增強病毒對植株的侵染。CDCP48H與泛素蛋白酶體系統降解相關，可能介導腫瘤細胞增殖調控的機制基礎[32]。可能通過調節細胞生理周期來降低病毒蛋白的表達。TTSCL硫胺素在所有生物體的幾種酶反應中是一個必要的輔助因子[33]。

4 結論

本研究成功篩選到了15個與TSWV N蛋白相互作用的寄主蛋白，它們具有豐富多樣的生物功能，因此，我們推斷N蛋白的功能同樣具有多樣性，尤其在病毒裝配和成熟，病毒反防御寄主植物免疫系統等過程中發揮重要作用。