利用物種特異性PCR技術(shù)快速鑒定南瓜實蠅

黃 振，侯有明 ，郭瓊霞 ，陳韶萍,

（1. 福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002；2. 福州長樂機場海關(guān)，福建 福州 350209；3. 福州海關(guān)技術(shù)中心，福建 福州 350001）

0 引言

【研究意義】南瓜實蠅Bactrocera tau（Walker），屬雙翅目Diptera、實蠅科Tephritidae、果實蠅屬Bactrocera[1]，是我國進境植物檢疫性害蟲。卵、幼蟲、蛹能隨寄主如果蔬、土壤、包裝物等可進行遠距離傳播。南瓜實蠅食性雜、寄主廣，達16個科80余種[2]，主要危害南瓜、角瓜、絲瓜、黃瓜、葫蘆、苦瓜、桑椹、西瓜、菠蘿蜜、楊桃、芒果、番石榴、番茄、扁蒲、菜豆等瓜果植物，對葫蘆科植物危害尤為嚴重[3]。Walker1849年首次在中國報道[4]，目前主要報道分布在越南、緬甸、泰國、老撾、日本、柬埔寨、馬來西亞、菲律賓、新加坡、不丹、斯里蘭卡、印度、印度尼西亞等地[5?6]。國際果蔬貿(mào)易給南瓜實蠅的傳入傳播帶來了極大的潛在風險[7]，日常分類鑒定工作通常以成蟲外部形態(tài)特征作為分類鑒定依據(jù)，而日常檢疫中經(jīng)常截獲幼蟲、卵或蛹，甚至翅、足等殘體，無法快速、準確鑒定，通常是在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)為成蟲后進行鑒定，耗時較長，嚴重影響果蔬進出口貿(mào)易的通關(guān)速度。因此，建立快速、特異、有效的PCR技術(shù)，對快速鑒定南瓜實蠅具有重要的現(xiàn)實意義。【前人研究進展】采用分子生物學的方法開展昆蟲種類鑒定，可以解決通過傳統(tǒng)形態(tài)特征不能進行實蠅種類鑒定的問題。越來越多的分子鑒定技術(shù)被運用于昆蟲的鑒定[8]。Mun等[9]應用限制性內(nèi)切酶Apa I、Nhe I和Sac I，將南瓜實蠅、桔小實蠅和地中海實蠅等4種實蠅區(qū)分開來。吳佳教等[10]用PCR-RFLP技術(shù)對我國口岸截獲頻率較高的9種檢疫性實蠅開展了研究，用限制性內(nèi)切酶MSE1和DRAI對PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，用得到的酶切位點將供試的9種實蠅區(qū)分開來。張亮等[11]通過 RAPD 技術(shù)構(gòu)建了南瓜實蠅、黑膝實蠅B. scutellaris等6種實蠅的指紋圖譜的分種鑒定。林麗莉等[12]應用RFLP技術(shù)，對我國部分地區(qū)發(fā)生分布的蜜柑大實蠅B. tsuneonis（Miyake）和橘大實蠅B. minax（Enderlein）開展鑒別研究。Chua等[13]采用RFLP技術(shù)成功地區(qū)分了洋桃實蠅和木瓜實蠅，進而使桔小實蠅復合種的有效識別得以實現(xiàn)。Kakouli等[14]用擴增片段長度多態(tài)性技術(shù) AFLP進行了實蠅種類的檢測鑒定。然而，上述對實蠅的檢測鑒定技術(shù)各有優(yōu)缺點，如 RFLP和RAPD技術(shù)具有需求DNA的量較少、基因的多態(tài)性豐富、對基因組的覆蓋范圍比較廣等優(yōu)點；但RFLP技術(shù)由于操作繁瑣，需通過檢測內(nèi)切酶識別位點上的變異，來進行昆蟲種間親緣關(guān)系和昆蟲種屬特異性鑒定，多態(tài)性檢出率低，而RAPD 技術(shù)的穩(wěn)定性較差，對試驗環(huán)境因子變化較為敏感，擴增的產(chǎn)物可重復性、穩(wěn)定性較低等，限制了RFLP和RAPD技術(shù)的廣泛應用[15]。雖然AFLP技術(shù)可以較好地彌補上述兩種技術(shù)方法的不足，但AFLP技術(shù)對檢測樣本DNA的質(zhì)量要求較高，且所需設備的費用較為昂貴。因此，上述的檢測方法難以滿足口岸進出境果蔬貿(mào)易快速通關(guān)、準確鑒定及低成本的檢疫需求。因為mtDNA COⅠ基因相對保守，排列的順序比較穩(wěn)定緊密，容易被通用引物擴增，又有足夠的特異性能將不同物種區(qū)分開，所以mtDNA COⅠ基因作為標記基因，為生物分類學提供了信息化的分類標準和有效的分類手段，成為目前昆蟲分類鑒定及昆蟲分子進化系統(tǒng)研究應用較多的基因之一，并被應用于實蠅近緣種的系統(tǒng)發(fā)育研究[16?18]。【本研究切入點】基于RAPD、AFLP、RFLP等技術(shù)在實際應用中表現(xiàn)的不足[19]，本試驗在前人利用COI標記鑒定技術(shù)的基礎上，利用mt DNA COI基因序列，篩選并設計種特異引物[20]，采用SS-PCR方法快速鑒定南瓜實蠅。【擬解決的關(guān)鍵問題】應用種特異性引物快速鑒定南瓜實蠅的方法，實現(xiàn)對口岸進境水果攜帶并截獲的疑似南瓜實蠅的卵、幼蟲、蛹、成蟲及成蟲殘體的快速鑒定。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

供試蟲樣：南瓜實蠅B. tau（Walker）、洋桃實蠅B. carambolae Drew & Hancock、瓜實蠅B. cucurbitae（Coquillett）、辣 椒 實 蠅B. latifrons（Hendel）、腿端黑實蠅B. atrifemur Drew & Hancock、番石榴果實蠅 B. correcta（Bezzi）、二 顏 帶 實 蠅 B. cilifera（Hendel）、桔小實蠅B. dorsalis（Hendel）、銹紅果實蠅B. rubigina（Wang & Zhao）、瘤脛實蠅B. tuberculata（Bezzi）、具條實蠅B. scutellata（Hendel）、何氏華實蠅B. hochii（Zia）、近黑顏實蠅B. parater（Zhao &Lin）、黑顏實蠅B. diaphora Coquillett、黑膝實蠅B.scutellaris（Bezzi）、滇寡鬃實蠅B. modica（Hardy）、瑞麗果實蠅B. ruiliensis Wang, Long et Zhang, sp. nov.、五指山實蠅B. wuzhishana Lin et Yang, sp. nov.、棗實蠅Carpomya vesuviana Costa、瓜棍腹實蠅Dacus longicornis Wiedemann等20種實蠅，其中除Bactrocera屬18種外，另有 Carpomya、Dacus2個屬的種類各1種。蟲樣來自口岸進境果蔬檢疫截獲、中國邊境監(jiān)測、調(diào)查和誘捕的檢疫性實蠅種類。用于分子生物學鑒定試驗的實蠅標本，放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 DNA提取和質(zhì)量檢測

將20種實蠅蟲樣放置于2 mL的離心管中，加入適量液氮充分研磨，根據(jù)用OMEGA E.Z.N.A.TMInsect DNA Kit試劑盒的操作方法，對蟲樣進行基因組DNA的提取，并放置于?20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

DNA質(zhì)量檢測采用上游引物LCO1490（堿基序列為：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198（堿基序列為：5′-TAAACTTC AGGGTGACCAAAAAATCA-3′）的1對通用引物對20種實蠅蟲樣提取的基因組DNA進行質(zhì)量檢測，在定量梯度PCR儀上進行PCR反應，電泳，凝膠成像，拍攝記錄質(zhì)量檢測結(jié)果。

1.3 引物設計

通過數(shù)據(jù)庫（NCBI）查找已公布的南瓜實蠅的登錄序列，分析比較并選定登錄號為JN542420的線粒體mt DNA COⅠ基因序列，利用數(shù)據(jù)庫（NCBI）中提供的BLAST程序檢查同源序列，最終選定8種實蠅（表1）。

表 1 設計南瓜實蠅特異性引物所用實蠅種類及登錄號Table 1 Species and accession numbers of fruit flies used for designing B. tau-specific primers

應用數(shù)據(jù)庫下載FASTA格式，對表1中的8種實蠅序列進行序列比對，再根據(jù)SNP位點，利用Primer-Premier 5.0軟件進行人工設計引物，采用Oligo 6.44對設置的引物進行評定，最后應用數(shù)據(jù)庫（NCBI）中 的Primer-BLAST（BLAST：Basic Local Alignment Search Tool）DNA數(shù)據(jù)庫進行相似性比較分 析，檢查同源序列。

1.4 引物種特異性測試

測試南瓜實蠅引物的種特異性時，選取南瓜實蠅為陽性對照，其余的20種實蠅蟲樣為陰性對照，檢測驗證設計引物種特異性測試的反應體系和條件，電泳檢測，凝膠成像，查看有否擴增出預期大小 的目標片段，拍攝并記錄結(jié)果。

1.5 引物靈敏度測試

將提取南瓜實蠅的基因組DNA模板，按照10?1、10?2、10?3倍3種不同濃度稀釋，測試提取的南瓜實蠅DNA的稀釋濃度后的靈敏度。用設計的種特異性引物NF404和NR610進行PCR擴增，對DNA模板進行最低檢出閾值的測定，驗證本檢測方法的靈 敏度。

1.6 SS-PCR方法的應用與驗證

將福州長樂機場進境旅客攜帶果蔬中截獲的南瓜實蠅并飼養(yǎng)到成蟲，經(jīng)過專家鑒定復核，收集幼蟲、蛹、成蟲、足、翅等17個蟲樣，按照本研究的SS-PCR方法，將提取的基因組DNA為模板，應用種特異性引物NF404和NR610進行PCR擴增，來驗證 該方法的穩(wěn)定性與準確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 質(zhì)量檢測結(jié)果

采用1對LCO1490和HCO2198通用引物，對提取的20種實蠅蟲樣的基因組DNA模板進行PCR擴增，結(jié)果顯示所有的實蠅蟲樣的DNA均能擴增出一條單一整齊且清晰透明的，長度約700 bp的目標條帶（圖1）。

圖 1 利用LCO1490和HC02198 一對通用型引物對提取的實蠅DNA模板進行質(zhì)量檢測的結(jié)果Fig. 1 Utilization of universal primers, LCO1490 and HC02198,for testing extracted DNA templates from fruit flies

2.2 特異性引物選擇

應用Bioedit對已下載的JN542420.1、HM561566.1、JN542417.1、AY530891.1、AF423105.1、JX855917.1、KF998674.1、KF318598.1等8種序列進行ClustalW多重比對，通過篩選最終選擇的種特異性引物NF′404和NR′610（圖2）。

圖 2 8種果實蠅的ClustalW多重比對的部分結(jié)果（種特異性引物NF’404和NR’610序列位置用橫線劃出）Fig. 2 Partial result of ClustalW multiple comparisons on 8 fruit flies

NF′404：5′-TGCCTCGACGATATTCTGACT-3′；

NR′610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

將NF′404和NR′610利用NCBI數(shù)據(jù)庫提供的Primer-BLAST程序檢查同源序列，最終將正向引物NF′404第6個堿基C轉(zhuǎn)換成T，第7個堿基G轉(zhuǎn)換成A，第8、19個堿基A轉(zhuǎn)換成G，確定出引物NF404和NR610。

篩選出NF404和NR610種特異性引物，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。特異性引物NF404和NR610的序列分別為：

NF404：5′-TGCCTTAGCGATATTCTGGCT-3′；

NR610：5′-AACTGTGTTCAGCAGGTGGT-3′。

2.3 引物種特異性

選用篩選獲得的種特異性引物NF404和NR610進行擴增，結(jié)果表明：僅南瓜實蠅擴增出一條清晰透明且單一的約207 bp的條帶，其他20種實蠅種類樣本均未顯現(xiàn)目標條帶（圖3）。表明該試驗設計的NF404和NR610種特異性引物具有較強的特異性和穩(wěn)定性。

上海英濰捷基貿(mào)易有限公司對本試驗將所得到的PCR產(chǎn)物進行測序，將序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫進行相似性分析（BLAST），表明該段序列與數(shù)據(jù)庫中 的南瓜實蠅序列完全一致。

2.4 引物的靈敏度

應用核酸蛋白分析儀對提取的南瓜實蠅DNA模板的質(zhì)量濃度進行測試，質(zhì)量濃度為56.95 ng·μL?1。取3種不同濃度的DNA模版測定最低檢出閾值，結(jié)果表明：隨著模版質(zhì)量濃度的降低，擴增出的條帶逐漸變淡，在質(zhì)量濃度稀釋100倍后，仍可見較為明 顯條帶（圖4），說明本試驗方法靈敏度較高。

2.5 應用與驗證

采用SS-PCR快速鑒定技術(shù)對截獲的南瓜實蠅標

圖 3 引物NF404和NR610的種特異性驗證Fig. 3 Verification on species-specificity of primers, NF404 and NR610

圖 4 引物NF404和NR610的靈敏度驗證Fig. 4 Verification on sensitivity of primers, NF404 and NR610

本進行檢測驗證，取經(jīng)復核鑒定的幼蟲、蛹、成蟲及成蟲的足、翅或部分殘體等17個樣品經(jīng)過檢驗，均檢測有目標條帶（圖5），說明分子生物學鑒定結(jié)果與形態(tài)學鑒定結(jié)果一致，即基于mt DNA COⅠ基因建立的種特異性COⅠ引物具有很強的特異性，SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的方法可以應用于實際鑒定。

圖 5 SS-PCR快速鑒定南瓜實蠅的應用與驗證Fig. 5 Application and verification of SS-PCR for rapid identification of B. tau

3 討論

3.1 引物的特異性是快速準確鑒定的決定性因素

被選作分子標記的基因很多，但是COI（cytochrome oxidase I或coxI）基因被選為DNA條形碼的靶標基因，相對保守，種間變異大，容易被通用引物擴增，同時又有足夠的變異能夠?qū)⒔壏N、近似種等分開。本試驗選用mt DNA COI作為標記基因，在基因庫中篩選查找南瓜實蠅已公布序列進行比對分析，設計引物NF404和NR610，用南瓜實蠅作為陽性對照，用其形態(tài)相近的3個果實蠅屬4個亞屬19種實蠅作為陰性對照，目標種能特異性并穩(wěn)定地擴增出長度207 bp清晰且單一的目標條帶，其他實蠅種類均無條帶出現(xiàn)，表明設計引物的種特異性強，能夠鑒定南瓜實蠅。

3.2 SS-PCR檢測鑒定方法的實用性

采用SS-PCR檢測鑒定方法，不但可快速準確鑒定特異種類南瓜實蠅，而且可檢測到的DNA模板質(zhì)量濃度的最低檢出閾值為5.695×10?3ng·μL?1。在口岸進境的多批果蔬的檢疫檢測時，對發(fā)現(xiàn)的不同蟲態(tài)目標實蠅（飼養(yǎng)到成蟲及經(jīng)過專家形態(tài)鑒定復核），采用SS-PCR檢測鑒定方法，可在8 h之內(nèi)快速準確鑒定特異種類南瓜實蠅。同時，本試驗建立種特異性引物PCR方法檢測南瓜實蠅的不同蟲態(tài)用時短、DNA用量少、靈敏度高、儀器設備簡單、鑒定準確率高，能夠滿足口岸檢驗檢疫高通量快速通關(guān)和快速準確的要求，而且本研究建立的方法對南瓜實蠅的卵或蟲體部分殘體均可檢測，不受實驗材料存活狀態(tài)的影響，檢測靈敏度高。因此，種特異引物 PCR方法在昆蟲的快速鑒定和近緣種區(qū)分上有著 廣泛的應用前景。

3.3 對線粒體基因組的研究有待于進一步加強

目前，線粒體基因組在實蠅科害蟲中的應用較少，僅有3屬 14種，在已公開發(fā)表的大多文獻中只描述了新測定物種的線粒體基因組序列及其特點。對于利用線粒體基因組在實蠅科害蟲中進行物種鑒定、種群溯源、分子進化等方面的研究尚未見報道。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，獲得具有重要經(jīng)濟意義的實蠅種類的線粒體基因組序列研究顯得極為迫切，所以對實蠅科昆蟲線粒體基因組的研究和應用需要進一步加強。