沙門氏菌LAMP檢測方法的建立及其在蔬菜栽培土壤中的應用

呂 新，劉蘭英，陳麗華，李玥仁

（1. 福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，福建 福州 350003；2. 福建省農產品質量安全重點實驗室，福建 福州 350003）

0 引 言

【研究意義】沙門氏菌是最主要的病原微生物之一，由其引起的食物中毒占食物中毒病例的第1或第2位[1]。僅在2005—2011年，國外發生的19起蔬菜因病原微生物污染而引起的食源性疾病案例中，有11起是由沙門氏菌污染引起的，占比高達58%[2]。沙門氏菌也是我國食源性疾病的主要病原體，我國發生的細菌性食源性中毒事件中有80%左右由沙門氏菌引起[3]。國內已有多篇研究文獻發現胡蘿卜、香菜、香蔥、生菜等新鮮蔬菜中存在沙門氏菌污染風險[4?6]。蔬菜的沙門氏菌污染可能發生在從農田到餐桌的每個環節[7?8]，近年來，隨著對蔬菜供應鏈主要環節中沙門氏菌污染風險和來源的深入研究，發現沙門氏菌污染風險雖然貫穿供應鏈的每個主要環節，但仍以栽培環節，特別是蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染風險最大，也是沙門氏菌檢測和風險控制的重點[8?11]。【前人研究進展】目前環介導等溫擴增技術（loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）已經運用到多種食品中沙門氏菌的快速檢測中，因其具有快速、靈敏的優點備受關注。Hara-Kudo等[12]采用環介導等溫擴增技術，可以檢出沙門氏菌最低含量為2.2 CFU·管?1，并在1 h以內獲得檢測結果；張宏偉等[13]采用環介導等溫擴增技術檢測食品樣品中沙門氏菌最低檢出限為1.5 CFU·hg?1；王瑾等[14]采用實時熒光環介導等溫擴增技術，可檢測沙門氏菌最低含量為6 CFU·管?1，人工污染雞肉的檢出限為450 CFU·g?1，全程用時約7 h；Wu等[15]利用實時熒光定量環介導等溫擴增技術對生菜中沙門氏菌進行檢測，靈敏度達到了4 CFU.g?1，而檢測過程僅需3 h左右；龐心怡等[16]采用環介導等溫擴增技術快速檢測肉類中沙門氏菌，對人工污染的沙門氏菌肉樣檢測靈敏度達98 CFU·mL?1，而全程僅用時15 h。【本研究切入點】目前對沙門氏菌檢測多采用國標《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4 789.4—2016）方法，但該方法需要對待檢樣品進行預增菌、選擇性分離和生化試驗鑒定，操作繁瑣，耗時費力，僅篩選出沙門氏菌可疑菌落就需要3～4 d，后續的生化試驗還需2～3 d[17]，滿足不了沙門氏菌快速檢測的要求。而環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早在2000年由日本科學家Notomi[18]發明，該技術可在恒溫條件下（60～65 ℃）1h內完成核酸的高倍擴增，靈敏度比PCR技術高2～7個數量級，反應產物不僅可以通過瓊脂糖電泳、濁度儀和定量PCR進行檢測，也可以通過鈣黃綠素、羥基萘酚藍、SYBR Green I顯色后觀察[19,20]，目前已成功應用于沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、副溶血弧菌、志賀氏菌等多種病原微生物的檢測[14,21?23]，但國內尚未見有關蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測方法的研究報道。【擬解決的關鍵問題】本研究以沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invA）基因序列設計可視化LAMP檢測引物，建立基于鈣黃綠素顯色的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌可視化快速檢測方法，以期為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的防控提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 蔬菜栽培土壤 供試蔬菜栽培土壤樣品集自閩清縣東橋鎮綠輝蔬菜種植農場，樣品按S型多點采集土壤表層（0～20 cm）的混合樣，采樣后立即用冰袋包裝新鮮樣品帶回實驗室，人工除去植物殘體、根系和石頭，過2 mm篩后測定土壤理化指標。供試蔬菜栽培土壤具體理化指標如下：土壤類型為黃紅壤，0～20 cm土層pH值5.31，有機質含量16.61 g·kg?1，堿解氮含量126.54 mg·kg?1，速效磷含量 18.25 mg·kg?1，速效鉀含量113.79 mg·kg?1。

1.1.2 材料與試劑 胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）（北京陸橋技術有限責任公司），DL2000 Marker、dNTP（Takara公司），Bst 2.0 DNA polymerase（美國NEB公司），瓊脂糖（西班牙Biowest），Betaine、Tween-20（上海生工），MnCl2、NaCl、Calcein（阿 拉 丁 公 司），FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒（美國MP Bio公司），無菌均質袋（ 北京陸橋）。

1.1.3 儀器與設備 PCR儀（BIO-RADTMS1000），凝膠成像系統（BIO-RADTMGel Doc XR+），FastPrepTMFP120核酸提取儀（美國MP Bio公司），easyMixTM拍擊式均質器（法國AES Chemunex公司），電泳儀及電源（北京六一儀器廠），恒溫水浴鍋（上海一恒 ），恒溫培養箱（上海一恒）。

1.1.4 菌株 表1為供試7種微生物菌株，分別來自中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）、中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）和美國典型 培養物保存中心（ATCC）。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據Genbank登錄的沙門氏菌特有侵襲蛋白A （invasion protein A，invA）基因序列（Accession: M90846.1），在網站（http://primerexplorer.jp/e/）上使用Primer Explorer 5.0在線軟件設計3對LAMP引物用于沙門氏菌檢測，包括1對外引物（F3/B3）、1對內引物（FIP/BIP）和1對環引物（Loop F/Loop B）。檢測引物交由上海生工合成。具體檢測引物序列見表2。

表 1 供試菌株Table 1 Bacteria used for testing

表 2 環介導等溫擴增引物Table 2 Primers of LAMP

1.2.2 沙門氏菌培養、計數及基因組DNA提取 將TSA平板內活化的沙門氏菌，挑取單個菌落接種于5 mL TSB液體培養基中，37 ℃、180 r·min?1過夜培養15～18 h，以1∶100比例轉接于100 mL TSB液體培養基，37 ℃、180 r·min?1培養3 h左右至細菌對數生長期（OD600≈0.55）。菌液使用生理鹽水按10倍梯度依次稀釋后，分別取100 μL不同濃度稀釋液涂于TSA平板上，37 ℃倒置培養18～24 h計數。

沙門氏菌DNA模板采用熱裂解法提取，取1 mL沙門氏菌菌液在臺式離心機上10 000 r·min?1離心5 min，棄上清液，沉淀重懸于0.5 mL生理鹽水，加入等體積2×TZ裂解液，于99.5 ℃加熱10 min，冰上冷卻2 min后，在10 000 r·min?1離心5 min，取上 清液即為沙門氏菌DNA模板，?20 ℃保存備用。

1.2.3 LAMP反應體系和反應條件優化 分別對LAMP反應體系中dNTPs濃度、MgSO4濃度以及Betaine濃度，反應條件中反應溫度和反應時間進行優化，其中dNTPs終濃度分別為0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L?1，MgSO4終濃度分別為2、4、6、8、10、12 mmol·L?1，Betaine終 濃 度 分 別 為0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mol·L?1；反 應 溫 度 分 別 設 置58、59、60、61、62、63、64、65 ℃，反應時間分別為30、40、50、60、70、80、90 min。選用50 μmol·L?1Calcein-500 μmol·L?1MnCl2作 為 指 示 劑[24]，陽 性 反 應 顯 綠色，陰性反應顯橘黃色，每個因子設置3個重復，以 確定最佳反應體系和反應條件。

1.2.4 LAMP反應特異性檢測 分別以鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、產氣腸桿菌、大腸埃希氏菌O157:H7、單核細胞增生李斯特氏菌和英諾克李斯特氏菌菌株為材料，以熱裂解法制備各菌株DNA，驗證所建立LAMP檢測方法的特異性。取1 μL各菌株的DNA作為模板，采取已優化的反應體系和條件進行特異性分析，反應結束后，以管內顏色變化來判斷陰陽性，陽性為綠色，陰性為橘黃色；或將擴增產物在1.5%瓊脂糖電泳上檢測，陽性反應可觀察到特征性梯形帶，陰性反應則沒有出 現擴增條帶。

1.2.5 LAMP反應靈敏度檢測 以10倍遞減將沙門氏 菌 濃 度 稀 釋 為7×108～7×102CFU·mL?17個 梯度，以熱裂解法提取沙門氏菌DNA，然后取1 μL不同含量的沙門氏菌DNA作為模板，對LAMP反應靈敏度進行檢測。結果直接肉眼觀察，陽性反應顯綠色，陰性反應顯橘黃色，同時在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢 測。

1.2.6 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測 取10 g經國標方法檢測沙門氏菌陰性的蔬菜栽培土壤樣品，置于裝有90 mL蛋白胨緩沖水（BPW）的無菌均質袋中，分別加入滅菌生理鹽水稀釋至適宜含量的沙門氏菌0.5 mL，以制備含沙門氏菌含量為0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1的人工污染樣品，將均質袋放置在拍擊式均質器中拍打1 min，置37 ℃的恒溫培養箱中預增菌4 h。預增菌后重新混勻土壤樣品，吸取1 mL混勻土壤樣品至FastDNA?Spin Kit for Soil試劑盒中的土壤裂解管中，12 000 r·min?1離心3 min，吸棄上清，然后在FastPrepTMFP120核酸提取儀上提取土壤微生物總DNA，100 μL溶解土壤微生物總DNA，取1 μL作為LAMP反應擴增模板。

1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測 利用所建立的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測方法對采自全省不同蔬菜產區的41份土壤樣品進行沙門氏菌檢測，同時采用國標方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》）進行檢測分 析。

2 結果與分析

2.1 LAMP檢測方法的建立

通過反應溫度和時間進行優化，確定LAMP最適反應溫度為65 ℃，反應時間為1 h。優化后蔬菜栽培土壤中沙門氏菌LAMP檢測最佳反應體系25 μL包括：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.4 mmol·L?1dNTPs，0.2 μmol·L?1F3-B3，1.6 μmol·L?1FIPBIP，0.4 μmol·L?1Loop F～Loop B，0.8 mol·L?1Betaine，6.0 mmol·L?1MgSO4，8 U Bst 2.0 DNA polymerase，50 μmol·L?1Calcein和500 μmol·L?1MnCl2，DNA模板1 μl，滅菌超純水補足25 μL體積。優化的LAMP反應 效果如圖1所示。

圖 1 LAMP體系檢測沙門氏菌Fig. 1 Detection of Salmonella using optimized LAMP assay

2.2 特異性檢測結果

分別以鼠傷寒沙門氏菌菌株和非沙門氏菌菌株的DNA為模板進行LAMP反應特異性分析，結果表明，在Calcein-MnCl2指示劑的作用下，65 ℃溫育1 h后，鼠傷寒沙門氏菌LAMP反應產物顯綠色，而供試6個非沙門氏菌菌株的LAMP反應產物均顯橘黃色（圖2-A）。進一步取2 μL擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果除鼠傷寒沙門氏菌LAMP擴增產物出現梯形條帶外，其他6個菌株均未出現任何條帶（圖2-B）。結果表明，本研究所建立的可視化LAMP檢測方法對沙門氏菌具有良好的特 異性。

2.3 靈敏度檢測結果

分別以7個不同含量沙門氏菌DNA為模板進行擴增來驗證LAMP體系的靈敏度，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果顯示，在每管25 μL LAMP反應體系中沙門氏菌DNA含量為7×105～7 CFU時均可以出現LAMP產物特有的梯形條帶（圖3-A），而當沙門氏菌DNA含量為7 ×10?1CFU時沒有出現任何條帶。可視化顯色結果與瓊脂糖凝膠電泳結果一致（圖3-B），說明L AMP反應體系可以檢測到7 CFU沙門氏菌DNA。

圖 2 LAMP方法檢測沙門氏菌的特異性Fig. 2 Specificity of LAMP assay in detecting Salmonella

圖 3 LAMP方法檢測沙門氏菌的靈敏度Fig. 3 Sensitivity of LAMP assay in detecting Salmonella

2.4 人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品檢測結果

人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品經37 ℃預增菌4 h后，提取土壤微生物總DNA進行擴增檢測。分別設置0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105CFU·g?1共7組 不 同 梯 度 進 行LAMP擴增檢測。瓊脂糖電泳結果顯示，當LAMP反應體系中沙門氏菌含量為4×102～1×105CFU·g?1時均可以出現LAMP產物特有的梯形條帶（圖4-A），而當沙門氏菌含量為5×101CFU·g?1時沒有出現任何條帶。可視化顯色結果與瓊脂糖凝膠電泳結果一致（圖4-B），說明本LAMP反應體系檢測蔬菜栽培土壤 樣品靈敏度為4×102CFU·g?1。

2.5 蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的檢測結果

應用上述LAMP檢測方法和國標檢測法，同時對全省不同蔬菜產區的41份土壤樣品進行沙門氏菌檢測，結果見表3。2種方法都檢測到2份沙門氏菌陽性樣品和39份沙門氏菌陰性樣品，LAMP檢測方法與國標方法（GB 4789.4—2016《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》）檢測結果一致，而LAMP檢測將國標方法檢測時間由5～7 d縮短至8 h內，大幅減輕 了檢測強度，提高了檢測效率。

圖 4 LAMP方法檢測人工污染沙門氏菌的栽培土壤樣品Fig. 4 LAMP assay for detecting artificially inoculated Salmonella in soil samples

表 3 2種方法對比檢測蔬菜栽培土壤沙門氏菌污染結果Table 3 Salmonella detection in soil by two different methods

3 討論與結論

快速檢測技術是監測和防控沙門氏菌等食源性疾病最重要的環節之一，而衡量快速檢測技術性能最關鍵指標是檢測用時與靈敏度。目前采用的國標檢測方法《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016），需要對待檢樣品進行預增菌、選擇性分離和生化試驗鑒定等步驟，操作繁瑣；最終拿到鑒定結果需要5～7d，耗時費力，難以滿足沙門氏菌快速檢測的要求。PCR方法雖然具有檢測時間短、靈敏度高的特點，但需要專門的檢測儀器（普通PCR儀或熒光定量PCR儀)，而環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有更高的靈敏度和視覺判斷性的優點，且檢測過程不需要專門的檢測儀器，彌補了國標檢測方法和PCR方法檢測沙門氏菌的不足。

沙門氏菌侵襲蛋白（invasion protein）基因簇是沙門氏菌編碼吸附和侵襲上皮細胞表面蛋白的基因，與沙門氏菌對腸道上皮細胞的侵襲有關，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因，其中以invA基因應用最為廣泛，目前根據invA基因序列設計特異性引物已成功應用于乳品、肉類、蔬菜等食品中沙門氏菌的檢測[14,15,21]。本研究根據沙門氏菌侵襲蛋白A （invA）基因序列設計特異性LAMP引物，建立了一種基于顏色判定的簡單、快速和靈敏的蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測方法，對沙門氏菌純菌檢測靈敏度可達7 CFU/25 μL，人工污染的栽培土 壤 樣 品 檢 測 靈 敏 度 為4×102CFU·g?1。采 用 該LAMP方法與國標檢測方法對比檢測蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染，結果表明LAMP檢測結果與國標方法檢測結果一致，說明該方法能成功應用于蔬菜栽培土壤中沙門氏菌的快速檢測，可為蔬菜栽培土壤中沙門氏菌污染的及時防控提供技術支撐。