瘤菌根菌對鐵皮石斛生長和營養成分的影響

王偉英，鄒 暉，戴藝民，林江波

（福建省農業科學院亞熱帶農業研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意義】鐵皮石斛（Dendrobium officinale）富含多種營養功效成分，其中鐵皮石斛的多糖含量豐富且多為功能性多糖，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老、增強機體免疫力等生理功能[1?3]。而石斛倍半萜類生物堿是石斛屬植物特有的石斛堿，石斛堿與非甾體類抗炎藥藥理作用相似，具有免疫調節、抗炎、擴張血管等作用[4?5]；氨基酸與藥效也存在著密切關系，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸是發揮臨床與保健功效的重要成分[6?7]，對人體也有良好的保健作用。因此，鐵皮石斛的多糖和石斛堿等營養成分在藥用和保健上都有很大的應用價值。同時鐵皮石斛是一種典型的內生菌根植物，菌根真菌參與整個生長發育過程，對種子萌發、植株營養生長、生殖繁育具有促進作用[8?10]。內生真菌在鐵皮石斛的人工栽培、引種馴化以及資源再生和保護等方面也具有重要的應用價值和前景。【前人研究進展】內生真菌在石斛的生長發育中起著促進生長的作用，主要表現為提高鮮重、干重、株高、莖長、莖粗、莖節數、節間長、分蘗株數以及新根數等[11?12]，也可增加B、Si、Fe、Cu和Mn等營養元素的含量[13]，還可促進多糖、石斛堿以及氨基酸含量等主要營養成分的積累[14?15]。【本研究切入點】目前有關瘤菌根菌與鐵皮石斛互作的研究主要以組培苗為研究材料[16]，而對室外的土栽盆苗的研究還較少，室外的土栽盆苗的種植條件與大棚種植更為接近，因此對鐵皮石斛的種植更具有指導意義。【擬解決的關鍵問題】本課題組在前期已分離出瘤菌根菌[17]，并通過與鐵皮石斛根共培養后建立共生關系形成菌根且能定殖于根中，誘導根系結構發生改變生成側根，同時也促進鐵皮石斛植株的生長[18]。因此本研究將在瘤菌根菌與鐵皮石斛形成互作關系的基礎上研究鐵皮石斛地上部的農藝性狀及其不同生長年限鮮條的營養成分的變化，為內生真菌在鐵皮石斛的人工栽培應用奠定理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為冠豸山野生鐵皮石斛，瘤菌根菌菌種標本保藏于福建省農業科學院亞熱帶農業研究所。

1.2 儀器

Thermo U-3000液相色譜儀（美國Thermo公司）；L5S型紫外見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；L-8800型氨基酸自動分析儀（日本日立高新技術公司）；UPW-20N型超純水機（北京歷元電子儀器有限公司）；BS110S型分析天平（德國Sartorius集團）；101A型恒溫鼓風干燥箱（上海市實驗儀器總廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 石斛盆栽苗的準備 泥炭土高溫滅菌后裝入未使用過的花盆，在3月份將鐵皮石斛組培苗種在花盆中，每個處理12盆，每盆種3叢，每叢3株石斛苗。

1.3.2 菌液培育與接菌處理 配制液體PDA培養液，接入瘤菌根菌，放入搖床，180 r·min?1，28 ℃，震蕩培育7 d后用粉碎機攪碎大塊菌絲至均勻，設置接菌的為處理組（T），用5 mL移液槍將菌液接種在石斛的根基部，每叢分3點各接5 mL，接12盆。未接菌的為對照組（CK），用5 mL移液槍將無菌培養液接種在石斛的根基部，每叢分3點各接5 mL，接12盆。種后當年的3～6月份每月接菌1次，接菌4次，當年封頂的鮮條保留在盆里，次年鐵皮石斛長出芽，新芽苗生長至封頂后的鮮條為1年條，而前一年的鮮條為2年條。在花芽分化時分別剪取1年條和2年條，并分別測定每根鮮條的長度、莖粗、有效莖數、莖重等。

1.3.3 指標測定 水分的測定參考GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[19]；粗蛋白含量的測定參考GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[20]；灰分的測定參考GB5009.4—2016《食品安全國家標準食品中灰分的測定》[21]；粗纖維的測定參考GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》[22]；氨基酸的測定參考GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》[23]；粗多糖的測定參考SN/T 4260—2015《出口植物源食品粗多糖的測定》[24]；石斛堿測定參考申剛等HPLC法[25]；長度大于5 cm的鐵皮石斛莖稈為有效莖稈，統計每盆中的有效莖稈數，取平均值即為每盆的有效莖數；稱量每根的有效莖稈重量，取平均值即為平均單莖重。

1.4 數據處理

所有數據使用SPSS 19.0統計軟件，采用Studenttest分析方法進行檢驗處理間差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 瘤菌根菌對不同生長年限鐵皮石斛農藝性狀的影響

當石斛盆栽苗經過接菌共培養后，發現接菌處理的鐵皮石斛盆栽苗長出的新芽苗比對照的新苗多，且新苗生長旺盛，莖粗壯，葉片顏色濃綠, 而對照的新苗葉色綠中帶黃，生長較慢（圖1-A）。同時還發現接菌后1年生和2年生的鐵皮石斛的有效莖條都多于對照，且鮮條長度明顯長于對照（圖1-B、C）。這表明澆灌瘤菌根菌能促進鐵皮石斛新芽的萌發和生長，明顯提高了鐵皮石斛的有效莖數。

圖 1 瘤菌根菌對不同生長年限鐵皮石斛的農藝性狀的影響Fig. 1 Effect of Epulorhiza symbiosis on agronomic characteristics of one- and 2-year-old D. officinale plantlets

2.2 瘤菌根菌對不同生長年限的鐵皮石斛含水量、莖長、有效莖數、莖徑、莖重的影響

石斛產量與有效莖數和單莖重量密切關聯，在單位面積內既要足夠的有效莖數和莖長，且植株粗壯，才能提高產量。從表1可以看出，接菌培養后1年條和2年條的有效莖稈數都多于未接菌的對照，分別增加了65.67%和74.25%，差異顯著。莖長是衡量石斛產量的主要指標，試驗發現接菌后的1年條和2年條的莖長也都長于對照，增幅分別為43.51%和47.85%，差異顯著。接菌后的1年條和1年條的莖徑寬度也都寬于對照，寬度分別增加了34.21%和60.71%，差異顯著。接菌后的1年條和2年條的平均單莖重高于對照，增幅分為別55.29%和51.45%，差異顯著。莖重與莖長、莖徑成正比關聯，其中莖重與莖徑的相關系數r為0.95，顯著正相關；莖重與莖長的相關系數r為0.84，具有很強的線性正相關。因此從接菌后的鐵皮石斛的單莖重、莖長和有效莖數都高于對照的結果可以得出接菌后的鐵皮石斛產量也高于對照。

表 1 瘤菌根菌對不同年限鐵皮石斛的莖長、有效莖數、莖徑、莖重的影響Table 1 Effect of Epulorhiza symbiosis on length, viable stem count, diameter, and weight of one- and 2-year-old D. officinale stems

2.3 瘤菌根菌對不同年限鐵皮石斛的主要營養成分的影響

不同年限鐵皮石斛的主要營養成分見表2。接菌后的鐵皮石斛鮮條的含水量、粗蛋白都高于相同年限的對照，說明了接菌后加快鐵皮石斛的生長，也加快鐵皮石斛的代謝和提高合成物質的能力，提供較多生長所需的物質。而接菌后的粗纖維、灰分含量低于未接菌的對照，差異顯著，遠低于2015版《中國藥典》總灰分含量不得高于占干重5.0%的限量要求[26]。表2中還可以得出，2年條的多糖含量高于1年條的多糖含量，且差異顯著，其中接菌與未接菌的2年條多糖含量較高沒有顯著差異，但接菌與未接菌的1年條的多糖含量差異顯著，接菌后比未接菌的對照增加了30.39%，這說明接菌后既能促進鐵皮石斛植株的生長，也不影響多糖的積累。石斛堿是石斛的特征性物質，檢測結果可知，石斛堿在所測定的指標中含量最低，含量占鮮重的0.03%左右，符合2015版《中國藥典》石斛堿含量不得少于占干重的0.40%的限量要求[26]。

表 2 瘤菌根菌對不同年限鐵皮石斛的主要營養成分的影響Table 2 Effect of Epulorhiza symbiosis on major nutritional constituents in one- and 2-year-old D. officinale（單位：%）

2.4 瘤菌根菌對不同年限鐵皮石斛的氨基酸組成的影響

氨基酸是一切生命之元，植物在光合作用中在各種酶與酶系統的參與下可經生物化學作用合成氨基酸，對植物本身而言氨基酸能夠促進根系生長、壯苗、健株、增強葉片的光合功能及抗病蟲害能力，達到增產效果；對人體而言植物氨基酸能提供人體不能自己制造的必需氨基酸，對生命活動發揮著舉足輕重的作用。不同年限不同處理的4種鐵皮石斛氨基酸的測定結果見表3。由表3可知，試驗中的4種鐵皮石斛的氨基酸種類齊全，都檢出了17種氨基酸。檢測發現，相同年限的接菌處理后的鐵皮石斛條的氨基酸總量和必需氨基酸都高于對照，差異顯著；接菌后的1年條的氨基酸總量與未接菌的2年條的氨基酸總量相近，而必需氨基酸含量卻超過了未接菌的2年條的必需氨基酸含量。從必需氨基酸與非必需氨基酸（EAA/NEAA）的比值來看，1年條的EAA/NEAA的比值為0.61，已達到FAO/WHO的理想模式（0.60）。由此可見，接菌后的鐵皮石斛盡管產量提高，但氨基酸的含量和EAA/NEAA的比值都高于未接菌的對照，表明接菌后的鐵皮石斛的氨基酸營養價值高于未接菌的鐵皮石斛，接菌后1年條的氨基酸營養價值可達到未接菌的2年條的氨基酸營養價值水平。從氨基酸組成看，1年條、2年條鐵皮石斛中氨基酸的種類和含量的高低順序基本一致，含量最高的是天冬氨酸，其次是谷氨酸、精氨酸、賴氨酸和蘇氨酸。其中天冬氨酸和谷氨酸是呈鮮味的特征氨基酸，兩者均占總氨基酸含量的30%以上，具有調節口感的作用。

3 討論與結論

近年來，很多藥用植物野生資源不合理的過度開發利用，造成了資源面臨枯竭，人工種植成為一條必然之路。但在人工種植中往往會出現生物產量和經濟產量的提高與有效成分的含量下降的矛盾[27]。因此，既要保證較高的有效成分，又要有較高的產量也成了人工種植鐵皮石斛的主要難題。但產量與質量不是對抗性矛盾，如果采取特殊的栽培措施，如加強田間管理，及時施肥，促進植株健壯生長，是可以達到產量高有效成分也相對較高的效果。

藥用植物的產量是指單位土地面積上藥用植物群體的產量，即由個體產量和個體數量構成。鐵皮石斛產量與在單位面積內的有效莖數和單莖重量密切關聯，既要足夠的有效莖數和莖長，且植株粗壯，才能提高產量。目前已發現多種能促進鐵皮石斛生長提高產量的內生真菌，本試驗中的瘤菌根菌與鐵皮石斛盆栽苗共培養后，可以促進植株生長，增加有效莖稈和莖稈長度，提高了產量。這一結果與其他研究者的結果一致，其中金輝等[13]分離出的瘤菌根菌與組培苗共同培養60 d后，接菌組培苗平均鮮重增長率比對照苗高出了84.8%，俞婕等[28]發現菌株ZJSH1對鐵皮石斛植株苗有顯著的促生作用，董金海等[29]發現菌株NL-215對鐵皮石斛試管苗的鮮重、株高、葉綠素和糖等各項表觀及內含物指標上都有明顯的促進作用。菌根真菌的促生作用的原因可能是菌根真菌與根系共培養后形成和建立了互惠共生關系誘導產生植物激素，促進了根系側根和根毛的生成，進而形成了發達的地下部系統，能更好地吸收營養物質來供地上部莖和葉的生長[18]，促進了植株高度、葉片數和葉寬的增加[17]。其中根系所吸取的營養物質一部分來自菌絲圈和菌絲結逐漸降解形成的菌體的營養物質，為植物提供維生素B1、維生素的前體PABA氨基酸、生長調節劑和生長所需的多種微量元素[30]；另外一部分營養物質來自根系周圍的培養基成分或者土壤儲存的水分、空氣和礦質元素。

表 3 瘤菌根菌對不同年限鐵皮石斛的氨基酸組成的影響Table 3 Effect of Epulorhiza symbiosis on amino acid composition of one- and 2-year-old D. officinale

菌根真菌不僅能促進生長提高產量，還能提高多糖、蛋白質、氨基酸及生物堿等代謝成分的積累[31]。王秋霞等[12]通過15N穩定同位素標記發現瘤菌根菌和膠膜菌能顯著促進金釵石斛對有機氮的利用和石斛堿的積累；朱波等[16]研究結果：通過接種鐵皮石斛內生真菌可以提高多糖含量，促進甘露糖和醇溶性浸出物積累。本試驗發現接菌后1年條的多糖含量顯著提高，增幅達到30.39%；接菌后的1年條的氨基酸總量與未接菌的2年條的氨基酸總量相近，而必需氨基酸含量卻超過了未接菌的2年條的必需氨基酸含量。試驗結果與龔記熠[14]等研究結果相似，其認為內生真菌能減少金釵石斛幼苗葉綠素SPAD值的降低，保證光合作用有序進行，促進有機物的合成，增加干物質量；帥紅艷[30]認為瘤菌根菌一定程度上影響了調控系統，使得物質代謝、光合作用等增強，促進初級代謝產物（多糖、氨基酸）和次生代謝產物（生物堿）的合成和積累。

另外，影響有效成分的積累與生長年限和采收時間有關，唐麗等[32]認為總多糖主要集中于莖，以2年齡莖的含量最高，且隨著生長齡的增加而逐漸減少。而總生物堿主要集中于葉片，以1年齡葉的含量最高。吳經耀[33]研究得出鐵皮石斛頭年10月到翌年3月多糖含量最高，為最佳采收期。封頂后的石斛葉片會慢慢衰老脫落，在葉片脫落前其所含的營養物質一部分以氨基酸的形式轉移進莖干，此時莖干的氨基酸含量較高。因此適時采收也是提高藥用植物質量的至關重要的因素，在封頂之后開花之前是鐵皮石斛的最適采收期，所以在每年的3月采收更科學合理，此時口感和風味最好。這是由于鐵皮石斛鮮條每年在11～12月份封頂而停止生長，3～5月份為新芽和花芽分化，會消耗其積累的營養物質，且粗纖維的含量增加，影響咀嚼口感和風味。而當粗纖維較高時會降低養分的消化率以及腸道對一些小分子養分物質的吸收。

從當前的林下種植、仿野生種植來看，鐵皮石斛的有機種植將會是一種主要的種植模式，而鐵皮石斛內生真菌的開發和應用是解決鐵皮石斛有機種植產量問題的重要措施。本試驗中鐵皮石斛與瘤菌根菌建立共生關系后根系發達且根系活力增強，能吸收較多的營養物質供地上部生長，莖稈飽滿，莖皮薄，粗纖維少，粘汁多；葉數增多，葉面積增大且葉色濃綠，合成代謝物的能力增強，積累更多的多糖、蛋白質、氨基酸及生物堿，即提高了產量也提高了有效成分的含量，其中接菌后的1年條莖稈的營養價值與正常條件生長的2年條莖稈營養價值相近。因此，本試驗所用的瘤菌根菌在石斛的生產和種植上具有較大的應用前景，為實現高產優質的目的提供一條重要的途徑。