番茄SlSIP1L12基因負調控種子萌發(fā)的研究

崔寶祿，陳國平

（1. 黔南民族師范學院，貴州 都勻 558000；2. 重慶大學，重慶 沙坪壩 400044）

0 引言

【研究意義】Trihelix轉錄因子屬植物特有，其SIP1亞家族基因調控植物生長發(fā)育的研究還不成熟。番茄作為雙子葉模式植物和重要的蔬菜作物，其SIP1亞家族基因的研究更是被邊緣化。因此，研究SIP1亞家族基因的功能與調控模式，對提高該家族基因的認識、增強作物改良的力度具有重要意義。【前人研究進展】農桿菌Ti質粒特定區(qū)域含有生長素或細胞分裂素的編碼基因，其中tml位點（6b基因）參與了植物器官腫瘤的形成。部分植物Trihelix轉錄因子可與6b編碼的蛋白質互作，被稱為Nicotiana tabacum 6b-interacting protein 1（NtSIP1），其編碼基因主要在根、莖、成熟葉和植物頂端區(qū)均有表達；NtSIP1包含2個保守域，核定位信號區(qū)和DNA結合區(qū)；NtSIP1可促進6b蛋白與下游基因啟動子的結合，從而實現植物細胞的增殖；NtSIP1 對6b蛋白進入細胞核有促進作用，并通過轉基因試驗證實，NtSIP1與植物細胞增殖、細胞分裂等功能有關[1]。擬南芥中，與6b互作的蛋白Arabidopsis 6binteracting protein 1-like 1（ASIL1）屬于Trihelix轉錄因子，突變體asil1子葉性狀發(fā)生改變：幼苗積累白蛋白、脂肪酸等代謝物質，重要的是ASIL1可識別GT-box[2]。蛋白質結構分析表明：ASIL1的N末端和中心結構域變化較大，氨基酸序列中含有核定位信號和甘氨酸/脯氨酸富集區(qū)[2]。以上分析表明，Trihelix轉錄因家SIP1亞家族蛋白可與6b蛋白互作，其功能研究多見于植物種子。許多植物的基因組中均發(fā)現了SIP1亞家族的基因信息。禾本科植物谷子（Setaria italia）中含有10個基因[3]；苦蕎麥（Fagopyrum tataricum）中有9個假定的SIP1基因[4]；而十字花科大白菜（Brassica Rapa）中，發(fā)現19個假定的SIP1基因[5]。除此之外，yu等[6]研究證實，茄科植物番茄基因組中含有12個假定的SIP1亞家族基因，11個基因含有0～1個內含子，Solyc09g008850含有6個內含子，編碼256～532個氨基酸；在非生物脅迫和激素誘導下，利用轉錄組測序技術，初步分析了Solyc12g010890和Solyc07g055100基因響應外源因素的情況。【本研究切入點】雖然多種植物的SIP1亞家族基因被發(fā)現，但其生物功能的研究還不盡人意，有待進一步深入。番茄作為重要的模式植物，具有基因組小、基因組測序完整、遺傳轉化效率高且穩(wěn)定等諸多優(yōu)點，但番茄中SIP1亞家族基因的功能尚不明晰。【擬解決的關鍵問題】本研究以番茄自交品種AC++為研究對象，利用RNAi干擾技術抑制了番茄體內SLSIP1L12基因的表達，鑒定了番茄中SLSIP1L12基因的生物功能，為豐富Trihelix轉錄家族SIP1亞家族基因的遺傳信息提供了參考，更為茄科植物的新品種選育提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用番茄野生品種AC++（Solanum lycopersicom Mill. cv. Ailsa Craig，引自重慶大學，屬于高度自交品種，遺傳性狀穩(wěn)定、適應性強），種植在黔南民族師范學院溫室大棚中，光照16 h（27 ℃）和黑暗8 h（19 ℃）。待植株開花結果后，分別選取成熟植株的根、莖、葉、花，果實分為未成熟果實（Immature green，IMG）、成熟果實（Mature green，MG）、破色果實（Breaker, B）、破色后4 d（B+4）、破色后7 d（B+7），見圖1所示。所有材料液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱。

1.2 番茄SlSIP1蛋白的生物信息學分析

將擬南芥、番茄等已知物種報道的基因序列在茄科基因組數據庫SGN中搜索番茄所有SlSIP1蛋白的氨基酸序列。將檢索的氨基酸序列進行多重序列比對，根據比對的結果確定該基因編碼的氨基酸序列可能的保守結構域。利用氨基酸序列進行生物進化分析，預測該基因的生物功能。cDNA和基因組的比對采用網站（http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html）完成；保守區(qū)預測采用網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）完成；多重序列比對采用軟件ClustalX 和DNAMAN，進化樹分析采用軟件MEGA10。

1.3 基因克隆

利用RNAiso Plus提取試劑提取番茄材料RNA，利用M-MLV反轉錄酶對RNA進行反轉錄，獲得組織材料的cDNA作為基因克隆模板。搜索NCBI和SGN數據庫，設計引物cSlSIP1L12-F和cSlSIP1L12-R，擴增出編碼序列，連接到pMD19-T載體上測序。

1.4 植物激素和非生物脅迫處理

番茄AC++種子播種于營養(yǎng)缽中，生長35 d后用于外源激素的處理和非生物脅迫[7]。

生長35 d的番茄幼苗，分別接受噴水（一次性噴水，直到所有葉片滴水為止）、脫水（在水中清洗幼苗根系，直至土壤清洗干凈。放于室溫后，開始取樣，取處理的幼苗中部葉片）、機械損傷（取幼苗中部葉片，用剪刀剪碎葉片至長寬約為1 cm）處理0、1、2、4、8、12、24、36 h后，將處理材料放入液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱[8]。

生長35 d的番茄幼苗，分別采用噴水（對照，CK）、50 μmol·L?1IAA、50 μmol·L?1GA3、50 μmol·L?1茉莉酸 甲 酯（MeJA）、100 μmol·L?1ABA、100 μmol·L?1ACC噴淋1次，直到所有葉片開始滴水為止，分別于0、1、2、4、8、12、24 h后，取幼苗中部葉片放入液氮速凍后，存放于?80 ℃冰箱[9]。

1.5 RT-PCR分析

所有材料采用Trizol試劑提取總RNA，定量PCR采 用SYBR Premix Ex Taq II kit（Promega）體系：5.0 μL 2×SYBR Premix酶、0.5 μL引物、1.0 μL cDNA、3.5 μL去離子水。表達模式分析和轉基因沉默效率鑒定采用基因SlCAC為內參，處理采用基因SlEF1a為內參[10]，具體引物見表1。

表 1 引物設計Table 1 Primers applied

1.6 SlSIP1L12基因沉默株系的建立

以cDNA為模板，以SlSIP1L12-F和SlSIP1L12-R為引物，以Primer Star mix酶高保真擴增后，連接到pMD19-T載體上測序，序列比對分析后得到片段大小為455 bp的基因特異序列。采用雙酶切方式以正、反向的方式連接到中間載體pHANNIBAL，再連接到終載體pBI19上。然后，通過將質粒轉移至農桿菌LBA4404中，侵染番茄子葉，誘導愈傷組織，獲得轉基因幼苗，誘導生根，利用卡那霉素編碼基因NPTII設計引物，鑒定轉基因陽性植株。以 qSlSIP1L12為引物，利用qRT-PCR檢測轉基因株系的沉默效率。

1.7 種子發(fā)芽試驗

50粒均勻的轉基因和AC++種子播種在含有2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中（蒸餾水或加入了消毒劑硫柳汞），黑暗條件下，放入（15±1） ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胚根突出種皮2 mm作為萌發(fā)的標準，檢測種子 的發(fā)芽率，試驗重復3～5次[11]。

1.8 種子體內ABA總含量檢測

ABA含量的測定采用ABA的ELISA試劑盒（上海生工）[12]，試驗方法是：0.1 g發(fā)芽種子（轉基因和AC++種子在發(fā)芽7 d后），用濾紙吸水后，用液氮研磨，80%的甲醇抽提，1 000 r·min?1離心20 min，取上清液，用孔徑為0.45 μm的濾膜清除雜質后，按照ELISA說明書進行操作，在波長450 nm下檢測結果，并利用標準曲線鑒定ABA含量。

2 結果與分析

2.1 SlSIP1L12基因生物信息分析

以番茄AC++的cDNA為模板，擴增SlSIP1L12基因（基因ID：Solyc12g043090）的編碼序列。經測序證實，總長為1 125個堿基，編碼374個氨基酸，比報道的番茄品種1 706少3個堿基/1個氨基酸[6]，缺少的氨基酸是N末端第61位的谷氨酸，這可能與所用番茄的品種有關。進一步分析表明，該氨基酸序列的保守區(qū)位為135～222和302～358區(qū)段，保守區(qū)可形成Trihelix結構域、第四螺旋和一個保守中央結構域（圖2）；核定位單元信號為193～203和212～221區(qū)段。圖3進化分析表明，番茄SlSIP1L12與SlSIP1L5位于同一分枝，但SlSIP1L12與所有檢測蛋白序列的一致性均低于47.2%（表2），說明，番茄內部SIP1亞家族進化較明顯。

2.2 SlSIP1L12基因表達模式分析

為進一步預測基因的生物學功能，利用RTPCR檢測了SlSIP1L12基因在番茄品種AC++不同組織中的表達水平。結果表明，基因SlSIP1L12在莖、成熟葉中表達量最高，在花、果實等生殖器官和組織中次之，在根、幼葉中表達量最低（圖4）。

圖 2 SIP1亞家族蛋白結構Fig. 2 The structure of SIP1 proteins

圖 3 生物進化分析SIP1亞家族蛋白質Fig. 3 Phylogenetic analysis of SIP1 proteins

表 2 氨基酸序列一致性分析Table 2 The similarity of SIP1 proteins

2.3 SlSIP1L12對外源植物激素和非生物脅迫的響應

圖5-A表明，IAA、GA3、MeJA和ACC（乙烯合成的前體）等4種激素處理24 h后，SlSIP1L12基因表達水平并未發(fā)生顯著變化，而接受ABA處理時，SlSIP1L12基因的表達水平出現明顯變化：2 h后SlSIP1L12表達水平逐步提高，8 h后達到最高，為初始表達量的4.6倍。初步預測，SlSIP1L12是ABA下游的響應基因。圖5-B顯示，在接受機械損傷誘導時，SlSIP1L12的表達水平相比對照較穩(wěn)定；而脫水脅迫時，SlSIP1L12的表達受到顯著誘導，處理2 h后，SlSIP1L12基因的表達水平開始提高，36 h后，它的表達量最高，是初始水平的8.9倍。綜上所述，SlSIP1L12基因的功能可能與ABA的響應有關。

2.4 轉基因株系的鑒定

經轉基因鑒定，獲得6個沉默株系（圖6），沉默效率為64%～83%，而沉默效率最高的株系RNAi-13未結出果實。因此選擇沉默效率相對較高的2個株系RNAi-4和RNAi-5作為進一步研究對象。

圖 4 AC++不同組織中SlSIP1L12的表達模式Fig. 4 Expressions of SlSIP1L12 in different tissues of AC++

圖 5 不同處理下SlSIP1L12基因的表達模式分析Fig. 5 Expressions of SlSIP1L12 under treatments by different stimuli

圖 6 轉基因不同株系中SlSIP1L12的表達水平Fig. 6 Expressions of SlSIP1L12 in RNAi-SlSIP1L12 lines

圖 7 轉基因植株和AC++種子的發(fā)芽試驗 Fig. 7 Seed germination of transgenic and control plants

2.5 種子發(fā)芽情況的鑒定

本研究證實SlSIP1L12基因的表達受ABA誘導，而ABA對種子萌發(fā)有顯著的抑制作用，推測抑制SlSIP1L12表達可提高種子萌發(fā)速度。轉基因及對照番茄種子培養(yǎng)4 d后，RNAi-4和RNAi-5株系種子開始萌發(fā)，5～7 d時，轉基因株系種子的胚根進入迅速萌發(fā)期，9 d后發(fā)芽率趨于穩(wěn)定。而番茄AC++種子7 d后才開始萌發(fā)，7～9 d為快速萌發(fā)期，10 d后發(fā)芽率趨于穩(wěn)定（圖7-A）。在種子萌發(fā)7 d時，轉基因株系的胚根長度是對照的10～15倍（圖7-B、7-C）。以上試驗結果表明，轉基因株系的種子萌發(fā)速度比對照快2 d左右。

2.6 轉基因植株發(fā)芽速度快的機理研究

為進一步分析轉基因植株種子萌發(fā)速度快的原因，本研究檢測了依賴于ABA信號途徑的AREB基因和不依賴于ABA的DREB基因的表達水平[13]。圖8-A證實，2個基因表達均受到了抑制，說明SlSIP1L12基因的沉默抑制了植株體內ABA響應。進一步分析種子萌發(fā)7 d后ABA的含量，發(fā)現轉基因種子體內ABA的含量顯著降低（圖8-B）。因此，進一步證實了SlSIP1L12基因調控種子萌發(fā)的機理與ABA響應有關。

3 討論與結論

Trihelix轉錄因子SIP1亞家族含有保守的Trihelix結構域（前2個螺旋結構的N端是保守的色氨酸，第三個螺旋的保守色氨酸被異亮氨酸取代）、第四螺旋和α-螺旋中心結構域[14]。SIP1蛋白保守區(qū)比對結果顯示，SlSIP1L12屬于SIP1亞家族（圖2），但序列一致性分析證實，SIP1亞家族蛋白間的氨基酸一致性較低，說明了SIP1蛋白間保守區(qū)的序列一致性較強，但保守區(qū)以外的序列分化較明顯。沉默株系植株的表型分析說明，該基因與NtSIP1的功能相似[1]。而SlSIP1L12是否為6b的互作因子待進一步證實。

植物激素ABA誘導或抑制了許多下游基因的表達變化，而下游基因轉錄水平的改變對ABA響應及其相關生理作用有一定的干擾或促進作用，進而改變植物的生長或適應能力[15?16]。本研究在進行激素和非生物脅迫處理時，發(fā)現SlSIP1L12響應ABA和脫水脅迫的誘導（圖5）。因此推測，SlSIP1L12是ABA下游的響應基因，沉默SlSIP1L12的表達可能抑制植物對ABA響應。轉基因試驗證實，沉默株系的種子萌發(fā)速度比對照快2 d左右；發(fā)芽7 d后，轉基因株系胚根的長度是對照的10倍左右（圖7）。通常種子的萌發(fā)分為三個階段：吸水期、代謝期和萌發(fā)期。后兩個發(fā)育階段必然會受到激素的調控作用[17-18]。DREB為不依賴于ABA的脅迫誘導基因，AREB為依賴于ABA的脅迫誘導基因[19]。而試驗結果表明，AREB和DREB的表達水平均受到顯著抑制，說明抑制SlSIP1L12的表達除了降低ABA響應外，還改變了非ABA響應，其調控作用有待深入探索（圖8）。此外，相同條件下，轉基因株系的種子萌發(fā)速度快于AC++的原因可能與ABA的響應受到抑制有關。進一步試驗證實，發(fā)芽期間ABA的含量顯著低于對照（圖8），說明SlSIP1L12正調控了ABA的合成，但SlSIP1L12基因參與ABA信號途徑的機制，還有待進一步試驗驗證。

圖 8 沉默株系內下游基因與相關激素的檢測Fig. 8 Expressions of downstream genes in transgenic and control plants

種子萌發(fā)與否與內源激素ABA和GA的平衡密切相關，ABA促進種子營養(yǎng)物質的合成與脫水耐性，而GA促進營養(yǎng)成分的分解[20]。本研究中，SlSIP1L12基因的表達受到ABA和脫水脅迫的雙重誘導，而不響應GA3的誘導（圖5），因此推測，SlSIP1L12的基因功能與ABA途徑關系較密切。然而，GA與ABA存在許多交互作用，且乙烯、油菜素內酯、含氮化合物等激素也經常貫穿其中，并影響二者的作用[20]，因此，轉基因植株體內ABA響應基因表達或種子體內ABA含量的變化只是初步的驗證，ABA與GA激素的互作機制將在后續(xù)的研究中深入分析。

本研究克隆到Trihelix轉錄因子SIP1亞家族基因SlSIP1L12全長為1 125 bp。該基因主要在地上部分表達，可受ABA與脫水脅迫誘導。利用RNAi技術獲得的轉基因植株 葉片中，ABA響應基因的表達顯著受到抑制；轉基因植株種子的發(fā)芽速度快于對照，且發(fā)芽7 d時，轉基因種子體內ABA含量明顯小于對照。