居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍線粒體COI基因測序分析

高 杰 ，繆麗梅 ，宗振東 ，羅旭光 ，王哲奇 ，紅 海 *

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010）

居延海位于內(nèi)蒙古阿拉善盟額濟(jì)納旗，在巴丹吉林沙漠的北部邊緣，曾是西北地區(qū)最大的湖泊之一。流入居延海的黑水河、金額濟(jì)納河發(fā)源于祁連山。清代后居延海分為東西兩個湖泊，東居延海又叫蘇泊淖爾，西居延海又叫嘎順淖爾。1961年西居延海干涸，1992年東居延海干涸，大鰭鼓鰾鰍由此消失于此區(qū)域。2003年黑河改水工程后居延海又正式蓄水，使得大鰭鼓鰾鰍在居延海重新出現(xiàn)。

大鰭鼓鰾鰍 (Hedinichthysyarkandensis macroptera)是居延海特有的鰍科(Cobitidae)條鰍亞科(Nemacheilinae)鼓鰾鰍屬(Hedinichthys)魚類[1]。 目前，國內(nèi)外學(xué)者對大鰭鼓鰾鰍的資源狀況、生態(tài)特性、生物學(xué)特性、人工繁殖技術(shù)以及種群特征等方面進(jìn)行了相應(yīng)的研究[1-3]，但有關(guān)大鰭鼓鰾鰍的遺傳多樣性等方面的研究鮮有報道。遺傳多樣性可為遺傳育種和物種進(jìn)化提供遺傳基礎(chǔ),遺傳背景的調(diào)查分析對于物種的有效保護(hù)和合理利用至關(guān)重要[4]。線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)因其母性遺傳、無重組等特性，是研究近緣物種遺傳多樣性的理想分子標(biāo)記。線粒體COI(cytochrome oxidase subunit I)基因為位于線粒體DNA上的蛋白質(zhì)編碼基因，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定和群體遺傳學(xué)等方面的研究[5-8]。為了深入了解居延海大鰭鼓鰾鰍種質(zhì)資源的遺傳背景，此研究通過PCR擴(kuò)增和測序，分析大鰭鼓鰾鰍mtDNA COI基因的遺傳多樣性，為該魚在分子生物學(xué)的系統(tǒng)進(jìn)化和多樣性研究及合理開發(fā)和利用提供了初步科學(xué)依據(jù)。筆者及團(tuán)隊于2018年7月初對居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍進(jìn)行了系統(tǒng)采樣工作，以期通過線粒體COI基因測序分析，對居延海東西湖兩水域的大鰭鼓鰾鰍的基因關(guān)系進(jìn)行分析。

1 材料和方法

1.1 材料

2018年7月3日采集于內(nèi)蒙古阿拉善盟額濟(jì)納旗居延海的52尾大鰭鼓鰾鰍，其中東湖水域和西湖水域各采集26尾，標(biāo)本采集后經(jīng)形態(tài)學(xué)測量及稱重后編號，活體解剖取其背部肌肉置于95%的乙醇溶液中，并在-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取和鑒定。將保存于95%乙醇中的標(biāo)本組織取出，置于無菌蒸餾水中浸泡3 h以上，徹底除凈乙醇；用組織勻漿儀將其打碎，取約100 μg勻漿后的組織，采用promega Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒提取基因組DNA。提取的基因組DNA，用微量紫外分光光度計測量O.D.260/280比值以及DNA濃度。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量和純度。

1.2.2 引物設(shè)計。根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計擴(kuò)增COI區(qū)域的引物，序列如下：

L5956-COI:5'-CACAAAGACATTGGCACCCT-3'

H6558-COI:5'-CCTCCTGCAGGGTCAAAGAA-3'

1.2.3 PCR擴(kuò)增和序列測定?；驍U(kuò)增使用Takara Premix PrimeSTAR HS，反應(yīng)總體積50 μL，包括：PCR Premix 25 μL，上下游引物各 2 μL，模板 1 μL，補(bǔ)充滅菌水至50 μL。PCR反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性5 min，然后重復(fù)25個循環(huán)包括95℃變性30 sec，58℃退火30 sec，72℃延伸80 sec，最后72℃延伸7 min。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀下將擴(kuò)增良好的條帶進(jìn)行切膠回收，用天根DP209-03柱式膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物。純化后的PCR產(chǎn)物送至吉美公司進(jìn)行測序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。測定的DNA序列進(jìn)行人工校正，采用DNAMAN(Version 5.2.2)軟件進(jìn)行個體和各魚群間的序列比對，分析Cytochrome oxidase subunit I(COI)基因序列的核苷酸其堿基的組成、位點變異；用MEGA[10](Version 5.1)軟件的 Maximum Likelihood方法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹、遺傳距離和GC含量等分析。利用DANsp v5[9]軟件分析基因多態(tài)性及單倍型。

2 結(jié)果和分析

2.1 COI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

本項目對52個標(biāo)本的COI基因進(jìn)行了序列測定，得到了全部標(biāo)本的長度為645 bp左右的COI基因序列，擴(kuò)增的凝膠電泳結(jié)果見圖1。

圖1 COI基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

2.2 COI基因序列特征分析

2.2.1 GC含量分析。645 bp左右的COI基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果經(jīng)過校對和拼接后，同源排序得到52個魚標(biāo)本的同源基因序列626 bp。用DNA MAN、MEGA軟件分析同源序列，得到52個標(biāo)本的同源基因片段GC堿基平均含量為41.70%，每個標(biāo)本的GC含量詳見表1。

表1 52個標(biāo)本COI基因的GC含量

結(jié)果顯示，52個標(biāo)本COI基因的GC含量相當(dāng)，無明顯差異。

2.2.2 變異分析。52個標(biāo)本的所有626 bp同源基因序中，突變總數(shù)7個，存在多態(tài)性位點/突變位點7個，單倍型數(shù)目為6，單倍型多樣性（HD）為0.622，核苷酸的多樣性（PI）為 0.00147。

2.3 魚遺傳多樣性和遺傳分化

2.3.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析。由圖2可見，52個標(biāo)本的COI系統(tǒng)進(jìn)化樹彼此之間的遺傳距離相差不大，說明52個標(biāo)本的COI基因彼此之間差異不大。從圖3可以看出，52個標(biāo)本的Cytb基因分布在兩個大的分支上，不同的標(biāo)本在系統(tǒng)進(jìn)化樹上分布較散，表明不同標(biāo)本Cytb基因正在逐步進(jìn)化。從系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，D37、D43單獨(dú)形成1個分支，D37與D43之間的遺傳距離較遠(yuǎn)，其余50個標(biāo)本的Cytb基因單獨(dú)形成另一個分支；除D37、D43之外的50個Cytb基因為主流進(jìn)化分支 ， 該 分 支 向 著 D1、D3、D15、D18、D19、D20、D21、D29、D31、D35、D44、D48、D52 進(jìn)化， 在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)化到 D4、D7、D13、D27、D30、D39、D45、D47 形成1個小分支（圖3）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，COI基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分支與Cytb基因的進(jìn)化分支有差異（詳見圖 3）。

圖2 52個標(biāo)本COI基因的系統(tǒng)進(jìn)化圖

圖3 52個標(biāo)本的Cytb基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3.2 遺傳距離計算分析。遺傳距離計算結(jié)果顯示，52個標(biāo)本的COI基因遺傳距離彼此之間相差不大，平均遺傳距離都低于0.006，說明52個標(biāo)本的COI基因彼此之間親緣關(guān)系較近，遺傳距離與系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果一致。

D37與D43之間的平均遺傳距離為0.074，D37與其他 （除D43外的50個）標(biāo)本的平均遺傳距離為0.037，D43與其他（除D37外的50個）標(biāo)本的平均遺傳距離為0.077。D43的Cytb基因與其他標(biāo)本的平均遺傳距離大于D37與其他標(biāo)本的遺傳距離，表明D43的Cytb基因與其他50個標(biāo)本的親緣關(guān)系比D37與其他50個標(biāo)本的親緣關(guān)系遠(yuǎn)；說明D43的Cytb基因向著與其他標(biāo)本的Cytb基因不同的進(jìn)化方向進(jìn)化，這與Cytb基因的系統(tǒng)進(jìn)化圖是一致的。

3 結(jié)論

綜合居延海東湖26個樣本和西湖26個樣本，總計52個個體的COI基因特征、遺傳多樣性和遺傳分化分析顯示，52個標(biāo)本的COI基因彼此遺傳距離較近，說明居延海東西湖大鰭鼓鰾鰍標(biāo)本的親緣關(guān)系較近?；贑ytb基因的大鰭鼓鰾鰍單倍型多樣性指數(shù)和核苷酸多樣性分別為 0.716和0.0027，有較高的遺傳多樣性。推測大鰭鼓鰾鰍魚種群在經(jīng)歷過瓶頸效應(yīng)后，可能伴隨產(chǎn)生了迅速的種群擴(kuò)張與變異的積累，即提高了單倍型多樣性，但沒有明顯增加核苷酸多態(tài)性。

本研究中大鰭鼓鰾鰍Cytb基因序列表現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和低水平的核苷酸多態(tài)性及遺傳多樣性，而這些魚類近年來都面臨著生存受到威脅的局面，這也從側(cè)面說明，大鰭鼓鰾鰍這一特有的魚類品種需要持續(xù)加強(qiáng)保護(hù)、恢復(fù)和開發(fā)。

基于Kimura雙參數(shù)模型Cytb基因單倍型之間的遺傳距離在0.001～0.010，整體來看，單倍型之間的遺傳距離較小，說明大鰭鼓鰾鰍個體之間的基因交流不受限制。這是因為大鰭鼓鰾鰍運(yùn)動能力較強(qiáng)，個體間基因交流不存在地理隔離限制。

52個標(biāo)本的Cytb基因特征、遺傳多樣性和遺傳分化分析結(jié)果顯示，D43標(biāo)本的Cytb基因進(jìn)化方向與其余50個標(biāo)本的Cytb基因進(jìn)化方向不同，與其他標(biāo)本的遺傳距離最遠(yuǎn)，說明與其他標(biāo)本的親緣關(guān)系更遠(yuǎn)，單獨(dú)形成1個進(jìn)化分支。優(yōu)勢單倍型的個體適應(yīng)能力強(qiáng)，擁有更大的繁殖群體，而低頻率的單倍型則因其環(huán)境適應(yīng)能力差，擁有的繁殖群體較小，更容易對整個種群的遺傳多樣性造成不利影響。因此,需要持續(xù)加強(qiáng)對其種質(zhì)資源的評估，加大保護(hù)力度，合理開發(fā)利用,以保持盡可能多的遺傳多樣性，改善種群遺傳結(jié)構(gòu)，從而增加大鰭鼓醥鰍資源恢復(fù)及遺傳復(fù)壯的機(jī)會。