一株豬圓環病毒2型SY-12株的分離鑒定

李秋菊，孫明梅 ，費景春，潘志忠，魏 星

（1.松原職業技術學院，吉林 松原 138000；2.遼源市動物疫病預防控制中心，吉林 遼源 136220）

豬圓環病毒 2型 （Porcine Circovirus type 2，PCV2）感染是一種以斷乳豬進行性消瘦、呼吸困難、腹瀉及明顯的淋巴組織病變為主要特征的疾病［1-3］。研究表明，PCV2感染除了造成PMWS外，同時還與豬呼吸道綜合癥、豬皮炎和繁殖障礙等密切相關［4-5］。PCV2經常與豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)或豬細小病毒(PPV)并發感染或繼發細菌感染,使患病豬病情加重,導致基因缺失突變[6]。所以，通過當地流行毒株進行PCV2的分離鑒定，篩選免疫原性較強的毒株用于制備PCV2滅活疫苗，對PCV2防控具有十分重要的意義。

1 試驗材料

1.1 病料來源

從松原地區某發病豬場采集疑似豬圓環病毒感染病豬的腹股溝淋巴結，共12份。

1.2 試驗材料

PK15細胞，PCV檢測為陰性，由本公司研究室保存；基因組提取試劑盒、切膠回收試劑盒、質粒小提試劑和索萊寶公司Ex Taq DNA Ploymerase工具酶，購自TaKaRa公司；MEM培養基和胎牛血清，均購自Invitrogen公司。

2 試驗方法

2.1 病料處理

取疑似豬圓環2型病變腸系膜淋巴結和腹股溝淋巴結，加入5 mL MEM(含青霉素最終濃度為100U/mL、鏈霉素100U/mL)生長液研磨。加入3 mL氯仿，充分混勻，12000 rpm/min離心20 min。吸取上清液用0.22 um過濾除菌。將病毒懸液1 mL接種于長成單層的PK-15細胞，37℃ 5% CO2感作50 min，補充2% MEM營養液繼續培養24 h。棄上清液，用終濃度為0.3的M D-氨基葡萄糖37℃處理30 min。棄掉0.3的M D-氨基葡萄糖液，用MEM洗滌2次，用2%胎牛血清與雙抗的MEM繼續培養2～3 d，收集細胞毒液。

2.2 PCR鑒定與分型鑒定

根據已發表的PCV2序列設計PCV ORF2引物：ORF2F:5'-GCGGATCCGTGACGTATCCAAG-3'，ORF2R:5'-CACTAGTATAGGGGTTAAGTGGGG-5'，產物長度為702 bp；同時，設計另一對引物克隆其余部分基因片 段，FragLF：5'-GAATTCCTGCGGGGGCG GTGTCTTCT-3'；FragLR：5'-GTCGACCAATCCCCC AACCCTTGCCTACC-3'，產物長度為 1373 bp；并合成PCV2分型鑒定引物，以區別PCV2a和 PCV2b，PCV2aF：5'-CCAGTTCGTCACCCTTTCC-3'，PCV2a R：5'-GGGG GACCAACAAAATCTC-3'， 擴增長度為550 bp；PCV2b F：5'-GTGGTCTACATTT CCAGC AGTT-3'，PCV2bR：5'-GCTCAAACCCCCG CTC-3'，提取病毒 DNA，PCR反應體系：10×PCR 緩沖液2.0 μL、dNTPs 0.5 μL、CEU、CED 各 0.5 μL、Ex Taq DNA Ploymerase 0.25 μL、細胞總 DNA1.0 μL 和滅菌水15.40μL，總體積為20.0 μL。 PCR反應條件：95 ℃3 min，95 ℃1 min，65 ℃1 min，72 ℃1 min，共 35 個循環；72℃10 min。將PCR產物切膠回收，并連接轉化至大腸桿菌DH5α感受態細胞，對重組質粒進行PCR鑒定，鑒定陽性質粒測序。

2.3 核苷酸序列測定與同源性分析

將測序結果利用GenBank中BLAST軟件進行同源性對比分析。

2.4 病毒形態觀察

將凍融3次收獲的病毒培養液在12000轉/min離心30 min，除去細胞碎片。取上清液用2%磷鎢酸染色，透射電鏡觀察病毒粒子。

2.5 特異性鑒定

取PCV2強毒SY-12株病毒細胞培養物1 mL，加入等體積的PCV2陽性血清，37℃培養1 h。取200 μL接種于單層PK-15細胞，同時設不加血清的病毒對照和陰性血清對照。置37℃ CO2培養箱中24 h，換含3 mmol/L D-氨基葡萄糖鹽酸MEM維持液，繼續培養48 h。棄去維持液，用PBS洗滌3次，冷丙酮固定，150 μL/孔4℃ 30 min。 棄丙酮， 室溫下干燥，用PBS洗滌1次。加入工作濃度的鼠抗PCV2 CAP單抗，50 μL/孔37℃ 1 h。用PBS洗滌3次，加入工作濃度FITC標記的羊抗鼠二抗，50 μL/孔，37 ℃ 1 h； 移去孔內液體，用PBS洗滌3次。熒光顯微鏡下觀察。

3 結果

3.1 病毒分離

病毒分離見圖1。

圖1 病毒分離（PCV2 SY-12F0）染色結果

3.2 PCR鑒定及分型鑒定結果

采用PCV2引物通過PCR對疑似病例的淋巴組織進行擴增,經瓊脂糖凝膠電泳后觀察到2條長度約為702 bp和1375 bp的電泳條帶,與預期的片段大小一致(見圖2)。PCV2 SY-12株分型鑒定結果見圖3。擴增出330 bp具有PCV2b特異的片段，無PCV2a特異550 bp的特異片段，對照細胞中沒有PCV2a和PCV2b特異片段。上述結果說明，PCV2 SY-12株為PCV2b型毒株。

圖2 PCR鑒定結果

圖3 PCV2a,PCV2b分型擴增鑒定結果圖

3.3 序列測定和同源性分析結果

對克隆片段ORF2基因與XS基因分別測序，序列分析后，經拼接得到SY-12株PCV2的部分基因序列為1767 bp，與GenBank中歐洲株親緣關系最近，與AF055394序列同源性達99.8%。該株全基因序列如圖4。編碼氨基酸的分子演化分析結果如圖5。

圖4 PCV2 SY-12株部分氨基酸序列

圖5 PCV2 SY-12株與其他毒株氨基酸序列同源性比較

3.4 病毒形態電鏡觀察結果

病毒培養液經凍融后離心取上清液，2%磷鎢酸負染后顯微鏡下觀察到圓環病毒粒子 (箭頭所示如圖6)。

圖6 電鏡下觀察到的細胞分離物中的圓環病毒粒子

3.5 特異性鑒定結果

將PCV2陽性血清中和分離到的PCV2第3代病毒經熒光抗體染色，結果和正常感染病毒相比，熒光斑數量減少70%，病毒對照接種細胞孔和陰性血清作用細胞孔內均可見大量綠色熒光。

4 討論

豬圓環2型病毒自1997年發現至今，已證實與豬群中發生的許多疾病密切相關。因此，開展PCV2研究具有重要意義。本試驗通過對疑似感染的組織樣品進行PCV2-ORF2核酸檢測，確定該病料經PCV2感染后再用PK-15細胞進行病毒分離培養，通過間接免疫熒光鑒定及電鏡鑒定，證實該病毒為豬圓環病毒2型，即PCV2-WH株。同時將SY-12分離毒株與Gen Bank中已發表的國內外PCV2毒株進行核苷酸序列同源性分析，結果表明SY-12分離毒株與其他毒株核苷酸序列同源性達99.7%。本研究分離的SY-12分離株為吉林省做好該病的防治工作提供了科學依據。由于豬圓環病毒2型（PCV2）的生物學特性特殊，病毒在所有細胞中增殖的滴度不高，在細胞中復制需要依賴細胞生長周期S期的細胞表達蛋白。用D-氨基葡萄糖處理細胞培養物后有利于病毒的復制，感染細胞數量可提高30%。本試驗用PCR檢測得到的PCV2陽性病料經處理后接種PK-15細胞，然后用D-氨基葡萄糖處理，連續盲傳后進行熒光定量PCR及IFA檢測，分離到SY-12株，為進一步從分子水平研究PCV2在吉林省的流行、變異規律以及主要結構基因的特性奠定了基礎，也為吉林地區PCV2的診斷及預防奠定了基礎。

圖7 PCV2 SY-12株（F3）特異性鑒定結果