應用iTRAQ技術聯合PRM驗證技術篩選肝硬化患者急性腎損傷的早期預測生物標志物

王來亮，周芳芳，黃璐璐，羅群

急性腎損傷（AKI）是肝硬化患者常見并發癥，發病率可高達20%[1]。肝硬化并發AKI患者住院時間長，多器官衰竭的風險高，30 d的病死率是未并發AKI患者的10倍[2]。肝硬化并發AKI至今尚無特效治療，早期預測并干預是改善該類患者預后的重要措施。腎功能評估的主要指標血肌酐（Scr）受影響因素多，依賴Scr診斷AKI既不敏感也不特異。定量蛋白質組學的迅速發展對發現AKI新型標志物和研究其發病機制有著重要意義。同位素標記相對和絕對定量技術（iTRAQ）是一種定量蛋白質組學的經典方法，具有定量較準確，全面分析中低豐度蛋白等優點，彌補了其他如基于雙向電泳難以檢測出低豐度、小分子量蛋白的不足。平行反應監測（PRM）是目前新型的靶向蛋白驗證手段，具有高分辨、抗干擾，重現性好，成本更低的特點，譜圖可直接檢索數據庫，與iTRAQ蛋白質組學技術聯合可同時完成生物標志物的發現和驗證。本研究應用iTRAQ技術篩選肝硬化并發AKI的早期差異表達蛋白，并通過PRM技術對靶向蛋白進行驗證，從而篩選出肝硬化并發AKI的早期預測新型生物標志物，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年1月至2019年12月在中國科學院大學寧波華美醫院住院的肝硬化患者90例，均符合年齡≥18歲，入院時未確診為AKI，但存在AKI高危因素，且取得患者知情同意。排除器質性腎臟病者，已接受透析治療者，擬行或已行肝腎移植者，伴有腫瘤者，確認懷孕，預期壽命不足3 d者，無法對患者或法定代理人進行知情告知者。根據是否并發AKI將患者分為AKI組（肝硬化并發AKI）和對照組（肝硬化未發生AKI）。

1.2 方法

1.2.1 收集臨床資料包括患者年齡、性別、體質量指數（BMI），合并癥（高血壓、糖尿病等），AKI高危因素情況（大量放腹水、消化道出血、感染/自發性腹膜炎、大量使用利尿劑及靜脈使用對比劑等[3]），入院出現AKI高危因素后第1、2天Scr水平。

1.2.2 iTRAQ技術篩選差異蛋白留取出現AKI高危因素后第1天尿液10ml，置于―80℃冰箱保存待檢。樣本預處理，提取總蛋白溶液，分裝后用iTRAQ分析，參考Bradford法進行蛋白濃度測定，蛋白還原烷基化及酶解處理成多肽，同位素標記肽段，應用LC-MS/MS技術，反相色譜分離及反向色譜-TripleTOF分析，結合數據庫檢索，獲得差異蛋白的鑒定列表和定量信息。差異蛋白篩選標準為濃度升高至對照組的1.5倍以上。

1.2.3 PRM驗證靶蛋白從上述iTRAQ篩選的差異蛋白中選擇豐度較高的靶蛋白，制備樣本的肽段混合物，根據靶蛋白的豐度情況，事先對樣本進行富集；根據挑選的靶肽段信息，進行預實驗，調整流出時間，或者重新挑選靶肽段；對正式樣本進行PRM檢測及數據分析。

1.3 統計方法采用Stata 12.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差表示，不同時間段比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗；計數資料比較采用2檢驗或Fisher確切檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況11例（12.2%）患者在住院期間發生AKI，包括自發性腹膜炎5例，上消化道出血3例，大量放腹水1例，大量使用利尿劑1例，靜脈使用對比劑1例。AKI組男4例，女7例；年齡（62.1±14.7）歲；BMI（22±3.60）kg/m2；合并癥高血壓2例，糖尿病4例。對照組男44例，女35例；年齡（61.6±14.6）歲；BMI（23.54±4.09）kg/m2；合并癥高血壓17例，糖尿病20例。兩組上述差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

兩組在高危因素出現前和出現后第1天Scr水平差異均無統計學意義（均P＞0.05），高危因素出現后第2天時差異有統計學意義（t=8.78，P＜0.05）。AKI組在高危因素后出現第2天Scr水平較出現前明顯升高（P＜0.05），見表1。

表1 兩組高危因素出現前、出現后第1天及第2天Scr水平比較 mol/L

2.2 差異蛋白篩選及驗證AKI組與對照組在高危因素出現后第1天尿液中共篩選出289個差異蛋白，其中上調蛋白64個，下調蛋白225個。在上調的差異蛋白中，AKI組谷氧還蛋白-1（GRX1）與S100鈣結合蛋白A7（S100A7）在高危因素出現后第1天分別升高至對照組的1.76倍及1.51倍。PRM技術驗證結果顯示，AKI組GRX1與S100A7水平分別升高至對照組的2.51及2.17倍，與iTRAQ技術篩選時的濃度變化趨勢一致。

3 討論

GRXs屬于硫氧還蛋白（TRX）家族，在細胞對氧化應激反應中發揮重要作用[4]。GRX1主要位于腎遠曲小管細胞頂部。Godoy等[5]發現，在缺血再灌注小鼠模型中，GRX1在小鼠尿液中特異性分泌增加。GRXs既可作為氧自由基的清道夫，也可作為抗凋亡分子和轉錄因子的氧化還原調節因子。抑制GRX1表達水平證明可以抑制凋亡信號調節激酶1的激酶活性。細胞實驗發現，缺血再灌注處理的細胞中若GRX1蛋白表達增加，細胞存活率和增殖率均高，且氧化損傷程度較輕[5]。

S100A7、S100A8和S100A9是S100鈣結合蛋白的成員，主要來源于中性粒細胞，也可由單核細胞、活化的巨噬細胞、樹突狀細胞和黏膜鱗狀上皮產生。S100鈣結合蛋白是先天免疫系統的激活因子。Tan等[6]發現，S100鈣結合蛋白通過激活TLR4/NLRP3炎癥小體途徑參與對比劑AKI的發生。Dessing等[7]發現S100鈣結合蛋白在缺血再灌注后巨噬細胞介導的腎臟修復中起關鍵作用。Kim等[8]發現，S100鈣結合蛋白水平在腎前性AKI中不升高，而在腎實質性AKI中升高。S100鈣結合蛋白水平升高可能提示發生腎實質性AKI時免疫反應和炎癥活動激活[8]。另有研究發現，S100A7表達水平升高與腎損傷程度平行[6]。因此，S100A7不僅是一種炎癥標志物，而且在炎癥性疾病的發病機制中發揮著關鍵作用。本研究發現，iTRAQ技術聯合PRM驗證技術篩選出的蛋白GRX1與S100A7在肝硬化并發AKI患者尿液中明顯升高，且早于Scr變化，可作為肝硬化患者并發AKI的早期預測新型生物標志物。

綜上所述，尿蛋白GRX1與S100A7在肝硬化患者AKI高危因素出現后Scr未明顯變化時已升高，可能是肝硬化并發AKI的早期預測新型生物標志物。但本研究樣本量相對較小，且篩選出的標志物未在新的肝硬化人群中進一步驗證，有待將來在大樣本中進一步驗證。