HPLC法在《中國藥典》的應用與展望

柯 穎，洪小栩

(1 中國藥科大學，南京 210009；2 國家藥典委員會，北京 100061)

高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)法是20世紀60年代初期在經典柱色譜基礎上創立的一種分離分析技術，汲取了氣相色譜(GC)法的發展經驗。與經典色譜法相比，HPLC法具有分離效率高、分析時間短、檢測靈敏度高等優勢[1]。HPLC法在藥品研發和質量控制等領域應用廣泛，涉及藥品檢驗的各個方面，如藥品鑒別、雜質控制、含量測定等。HPLC法首次收載于《中國藥典》1985年版，在藥品質控中的應用日益廣泛，目前已成為藥品安全性、有效性控制最重要的檢測方法。

1 基本原理與類型

HPLC法與經典液相色譜法有所不同，基本原理是以液體為流動相，在高壓下利用不同組分與固定相和液體流動相的吸附能力、離子交換作用以及分配系數的不同而實現分離。根據保留時間的不同，對樣品各組分進行定性定量分析[2]。典型的高效液相色譜儀一般具備儲液器、高壓泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等主要部件。

HPLC法按照固定相和流動相的相對極性可分為正相色譜(normal phase chromatography)和反向色譜(reversed phase chromatography)。兩者區別見表1。

表1 正相色譜法與反向色譜法的區別

另外，為適應不同有機化合物的特性，保證絕大多數有機化合物的分離分析，裝有不同類型填料的色譜柱與相對應的流動相形成了不同的分離機制。按照分離過程的機制可分為分配色譜(partition chromatography)、吸附色譜(absorption chromatography)、離子交換色譜(ion exchange chromatography,IEC)、分子排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC)、親和色譜(affinity chromatography,AC)。

2 HPLC法在歷版《中國藥典》的應用

《中國藥典》1985年版首次新增了HPLC法，將其收入附錄。同時，在二部7個品種的含量測定方法中應用了HPLC法，分別為丙酸睪丸素注射液、葉酸、葉酸片、苯丙酸諾龍注射液、黃體酮注射液、維生素D3注射液、醋酸氟輕松軟膏。按品種數量統計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應用情況見表2和圖1。

表2 歷版《中國藥典》HPLC法收載情況 個

圖1 歷版《中國藥典》HPLC法收載數量趨勢

從表2和圖1可以看出，從《中國藥典》1985年版到2020年版的發展可分為4個時期：1985～2000年為起步期，HPLC法應用品種數目增多但是增長緩慢；2000～2005年為上升期，HPLC法應用品種數目增長明顯；2005～2015年為快速發展期，增長最為明顯的是《中國藥典》2010年版；2015～2020年為平穩期，HPLC法應用品種數目增多但是趨于平穩。

值得一提的是，在HPLC法的快速發展期間，《中國藥典》2010年版一部收載品種2165種，采用HPLC法的有1214種，占總數的56%；二部收載品種2271種，采用HPLC法的有1366種，占總數的60%。從最新頒布實施的《中國藥典》2020年版來看，一部、二部采用HPLC法的品種分別占總數的66%和72%。由此可見，當前HPLC法已成為《中國藥典》中最常用的檢測方法。

按檢測項目統計，HPLC法在歷版《中國藥典》中的應用情況見表3、表4和圖2、圖3。

表3 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目中的應用品種數量 個

表4 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目中的應用品種數量 個

圖2 HPLC法在歷版《中國藥典》一部不同檢測項目應用情況

圖3 HPLC法在歷版《中國藥典》二部不同檢測項目應用情況

自《中國藥典》1985年版收載HPLC法開始，該法最先應用于化學藥品的含量測定，并于《中國藥典》1990年版首次增加了HPLC法用于5種中藥品種含量測定。HPLC法在藥品質量控制方面的應用不斷普及，主要用于藥品安全性、有效性的質控項目。在化學藥品中，應用最普遍的檢測項目是鑒別、有關物質和含量測定；在中藥中，應用最普遍的檢測項目是鑒別和含量測定；在生物制品中，主要用于蛋白質純度測定。

化學藥品除了關注鑒別和含量測定項目以外，對有關物質的控制也格外注重。有關物質是指能影響藥物純度、降低主成分含量的雜質，主要包括生產過程中帶入的起始原料、中間體、聚合體、副反應產物、降解產物等[3]。基于安全性考慮，有關物質研究是化學藥品質量研究的關鍵項目，HPLC法常用于化學藥品的有關物質含量測定。從圖3可以看出，采用HPLC法測定有關物質含量的化學藥品品種數量增長迅速。化學藥品的鑒別試驗也越來越多地采用HPLC法替代紅外測定法。在含量測定方面，HPLC法更是首選的“黃金法”。

中藥材和飲片作為臨床用中成藥和湯劑的原料，其安全性和有效性一直是熱點話題。針對這兩方面的問題，每一版《中國藥典》的修訂，都把工作重點放在進一步加強中藥材和飲片的專屬性鑒別和質量控制上。中藥材和飲片所含成分結構多樣復雜，為鑒別和含量測定帶來巨大挑戰，給方法學的建立提出了更嚴格的要求[4]。面對挑戰，HPLC法憑借其穩定性和分離的可靠性，為中藥材和飲片鑒別和含量測定提供了技術手段，成為突破傳統中藥質量控制理念、推進質量控制現代化的有力工具。

生物制品的質量標準主要強調安全性、有效性和可接受性。由于受到純度的影響，藥效不能充分發揮，甚至對人體產生毒副作用。因此，生物制品在精制后，要求檢查純度是否符合規定。過去對生物大分子的分離主要依賴免疫電泳法，但有一定的局限性。HPLC法逐漸被開發用于生物制品的純度測定，以其重復性好、自動化程度高、檢測限低(達ng或pg級別)、回收率高且不失活等特點，成為生物制品純度分析的重要工具。

經過多年的發展，HPLC法的應用范圍不斷擴大，涉及各個藥品品種領域，主要用于鑒別、有關物質檢測和含量測定。以往多數采用薄層色譜法進行藥物鑒別，優勢在于使用簡便且成本較低，但是為了尋求更高的準確性，最終被HPLC法替代。采用HPLC法進行含量測定的優勢在于分離效率高，可應用于高沸點、熱穩定性差的化合物的分離分析，從而替代繁瑣的滴定分析法。

3 技術展望

隨著各國藥品標準的不斷提高，以及對分離純化技術的不斷探索，使得HPLC法發展迅速。HPLC法以其高效、準確性好、操作自動化等特點，已經普遍運用于藥物分析檢測的各個領域[5]。HPLC法最大的優勢在于藥品的定量檢查。目前，HPLC法的發展主要體現在兩個方面：一方面，通過革新技術仍保持其在定量領域的優勢，要求降低色譜柱顆粒度、加快色譜分離效率；另一方面，為了克服其在定性領域的劣勢，通過與其他分析技術聯用，如質譜(MS)、飛行時間質譜(TOF-MS)、核磁共振(NMR)等。

3.1 超高效液相色譜法

超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography，UPLC)是在HPLC法的理論基礎上，應用了新型小顆粒填料及裝填技術、超高壓液相色譜泵、低擴散、低交叉污染的自動進樣器以及快速檢測手段等全新技術。與傳統的HPLC技術相比，能獲得更高的柱效，其分離效率、靈敏度和分辨率都有很大的提高。因此，適合于中藥復雜成分的分離分析，在中藥研究領域發揮了重要作用。

李垚等[6]采用UPLC法測定丹參不同部位中丹參素、原兒茶酸等14種水溶性成分的含量，建立的UPLC法分離度好、靈敏度高，可實現準確定量。陳冉等[7]采用UPLC法測定了鮮川芎和川芎藥材中6種活性成分的含量。郭社民等[8]建立UPLC法，采用Acquity UPLC HSS T3色譜柱，可同時測定參杞通脈膠囊中人參皂苷Rg1、Re和Rb1的含量。

3.2 高效液相色譜聯用技術

高效液相色譜-質譜(HPLC-MS)聯用技術體現了色譜和質譜優勢的互補，以液相色譜作為分離系統，質譜作為檢測系統。其檢測原理是樣品通過液相色譜系統后由色譜柱分離，隨后質譜的質量分析器將離子碎片按質荷比分開，經檢測器后得到色譜圖，分析后可得知色譜峰中所有化學物質的相對分子質量信息，可用于識別分子結構以及純度的檢查，適用于極性強、揮發度低、相對分子質量大且熱不穩定的混合有機物體系[9]。HPLC-MS法的優點：高靈敏度、對樣品的選擇性高以及能對多種樣品成分進行定性定量分析[10]。但同時也存在一定的局限性，如復雜樣品基質的干擾物會對分析結果產生一定的影響，而基質效應很難消除。HPLC-MS的應用非常廣泛，為分子生物學、化合物的表征及鑒定、定量和定性分析、治療藥物監測中的自動免疫分析、臨床化學和毒理學等領域提供了一種強有力的檢測手段。

近些年發展的液相色譜-光譜技術包括高效液相色譜-二極管陣列(HPLC-PDA)、高效液相色譜-圓二色(HPLC-CD)、高效液相色譜-核磁共振(HPLC-NMR)等。HPLC-PDA法適用于大多數有紫外吸收的物質，可同時檢測多個波長，因此可以一次性得到樣品所有組分的信息，十分方便，但是對流動相選擇有一定的限制[11]。鑒于圓二色檢測器的選擇性較高，只對具有旋光活性的物質有響應，因此HPLC-CD法在復雜基質中手性化合物的分析以及在手性化合物絕對構型的測定中有很好的應用前景[12]。例如，采用HPLC-CD法分析甲霜靈的對映體純度[13]。HPLC-NMR法在分析未知雜質時，無需純品作對照，且沒有破壞性，充分發揮了其專屬性強、快速、準確的優點，能做到快速分離、結構鑒定并且對樣品進行定性定量分析。

4 小結

HPLC法在《中國藥典》中應用范圍不斷擴大，充分說明了該法在藥品檢測領域的重要地位。在《中國藥典》一部(中藥)部分，HPLC法主要用于特征圖譜的定性分析、指紋圖譜的半定量分析以及多成分的含量測定。在《中國藥典》二部(化學藥品)部分，HPLC法主要用于鑒別、有關物質與含量測定，對于復雜樣品體系，必要時采用固相萃取柱進行前處理和富集。在《中國藥典》三部(生物制品)部分，HPLC法主要用于蛋白質結構和純度分析。

現代HPLC法的發展將在技術革新、發展檢測器、創新色譜填料技術、完善理論等方面做出努力，促使HPLC法及其相關方法在各個領域的應用范圍不斷擴大，進一步穩固HPLC法的主流分析地位，具有廣闊的發展前景。