依澤麥布抑制膀胱癌細胞增殖、遷移及其機制

熊康平，彭天辰，熊垚祎，肖 宇，鞠林高，王 剛，王行環

(武漢大學中南醫院泌尿外科，湖北武漢 430071)

膀胱癌是世界上第10大常見癌癥，2018年有近20萬人死于膀胱癌，占所有癌癥死亡人數的2.1%[1]。我們急需尋找新的更高效的膀胱癌治療藥物。腫瘤代謝重編程中腫瘤細胞能改變其新陳代謝方式，課題組前期運用膀胱癌組織及正常膀胱上皮組織進行轉錄組學檢測分析，發現脂類代謝與膀胱癌關系密切[2]。膽固醇平衡紊亂是許多疾病如癌癥的發病基礎[3-4]。此外，更有報道稱細胞內膽固醇的合成與膀胱癌化療耐藥相關[5]。辛伐他汀能通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶來抑制內源性膽固醇的合成，從而降低血膽固醇水平。課題組前期使用辛伐他汀來抑制膽固醇的合成，發現辛伐他汀能有效抑制膀胱癌細胞的增殖與遷移，并誘導膀胱癌細胞在G0/G1期阻滯[6]。除抑制內生合成外，外源吸收的減少也能降低血膽固醇水平。依澤麥布(Ezetimibe)能抑制外源膽固醇的吸收，被用于高膽固醇血癥的治療。有研究認為，依澤麥布與辛伐他汀的合用在降低血膽固醇的同時增加了癌癥的患病率[7]，也有研究稱不能證明依澤麥布會對癌癥發生率產生不利影響[8-9]。甚至一些研究發現依澤麥布能有效抑制腫瘤的發展[10]。本研究采用兩種細胞系，探究依澤麥布對T24和5637細胞增殖、遷移的抑制及其原理。

1 材料與方法

1.1 細胞培養膀胱癌細胞系T24和5637來自于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，細胞系均經由中國典型培養物保藏中心認證。T24和5637置于含5%CO2的37 ℃細胞培養箱中，使用含有10%(體積分數)胎牛血清(Gibco，中國)，1%(體積分數)的青霉素與鏈霉素的RPMI-1640培養基(Gibco，中國)培養。

1.2 細胞增殖實驗采用噻唑蘭(MTT)法進行細胞增殖實驗。首先，向96孔板中的每個孔中加入100 μL含有3 000個膀胱癌細胞的RPMI-1640培養基，放入細胞培養箱中培養24 h；再用不同濃度的依澤麥布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)分別處理48 h；然后，向每孔中添加20 μL (5 mg/mL)MTT，于細胞培養箱37 ℃培養，4 h后移去孔內培養基，加入150 μL DMSO以溶解藍紫色甲瓚沉淀。最后用酶標儀 (Cat.#Spectra Max M2，Molecular Devices，USA)在波長490 nm處測量其吸光度值(A)，結果以相對細胞增殖率顯示，相對細胞增殖率=A(經依澤麥布處理組)/A(未經依澤麥布處理組)，實驗重復3次。

1.3 細胞劃痕實驗設置不添加依澤麥布的對照組，加入低濃度依澤麥布(20 mmol/L)與高濃度依澤麥布(40 mmol/L)的實驗組。T24和5637膀胱癌細胞接種于6孔板中，待其長滿后，用無菌槍頭刮一平整筆直的劃痕，并標記一固定位點，用PBS沖洗后，于6孔板中加入不同濃度的依澤麥布(0、20、40 mmol/L)，分別于0 h和24 h，用相差顯微鏡在標記位點拍照，計算其遷移率后進行統計學分析。遷移率=24 h后細胞邊緣移動距離/初始細胞邊緣距離，實驗重復3次。

1.4 細胞周期測定T24和5637細胞在含有不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)的培養基內培養48 h，胰酶消化后離心收集。用含有碘化丙啶和破膜劑的1xDNA染色劑(Multi sciences，China)重懸細胞，于黑暗環境中37 ℃培育30 min。用流式細胞儀 (Beckman，Cat.#FC500)分析其各組細胞周期分布狀況。每次分析1×105個細胞，實驗重復3次。

1.5 蛋白質分離與免疫印跡分析胰酶消化經不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)處理的膀胱癌細胞后，離心收集，于冰上加入含有磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(Sigma-Aldrich，USA)裂解細胞30 min。以12 000 r/min、4 ℃離心15 min，收集上清液，并加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃加熱變性10 min，于-20 ℃凍存備用。用7.5%～12.5%SDS-PAGE凝膠電泳進行變性與分離蛋白，用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上(Millipore，USA)，再以5%脫脂牛奶(BD Biosciences，USA)封閉1 h，與一抗孵育過夜，TBST洗膜，再與二抗孵育2 h。條帶使用增強化學發光試劑盒顯示(Bio-Rad，USA)，由分子成像儀Chemi Doc XRS +成像系統顯影記錄。

1.6 統計學分析所有的實驗均至少重復3次，采用單因素方差分析(ANOVA)和雙尾Student’st檢驗來評估各個亞組間是否具有統計學意義，所有數據均采用SPSS 16.0進行統計分析，P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 依澤麥布抑制膀胱癌細胞增殖T24和5637經過不同濃度依澤麥布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)處理48 h后，細胞的增殖能力明顯受到抑制，并且呈現出濃度依賴性(P<0.05，圖1)。

圖1 依澤麥布對細胞增殖的影響

2.2 依澤麥布抑制膀胱癌細胞遷移應用劃痕實驗在不同濃度依澤麥布(0、20、40 mmol/L)處理2種膀胱癌細胞24 h后，測量其遷移率，發現兩種濃度的藥物均能顯著抑制細胞的遷移能力，高濃度的依澤麥布對其遷移率影響更大(P<0.05，圖2)。

2.3 依澤麥布影響膀胱癌細胞周期通過流式細胞術發現依澤麥布能影響膀胱癌細胞的周期分布，結果顯示高濃度依澤麥布(40 mmol/L)使T24和5637的細胞周期在 G0/G1被顯著阻滯，而在低濃度時(20 mmol/L)，與對照組相比，也可誘導細胞周期在G0/G1期被阻滯(P<0.05，圖3)。

2.4 依澤麥布影響膀胱癌細胞表型相關蛋白表達水平用Western blot分析參與上皮-間質轉化(EMT)過程與細胞G0/G1周期相關的蛋白質，包括β-連接素(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)、CDK2、CDK4，WB結果顯示兩種膀胱癌細胞系在低、高濃度的依澤麥布組中的CDK2、CDK4、β-catenin及vimentin的表達均呈劑量依賴性下降(P<0.05，圖4)。

A、C：不同濃度依折麥布處理5637、T24細胞的傷口愈合實驗;B、D：不同濃度依折麥布處理5637、T24細胞后遷移率統計；**P<0.01，*P<0.05

A：流式細胞術分析細胞周期；B：依折麥布處理5637、T24細胞后G0/G1期、S期、G2/M占比分析，*P<0.05。圖3 依澤麥布對細胞周期的影響

圖4 依澤麥布對細胞蛋白表達的影響

3 討 論

流行病學報道稱，高膽固醇飲食與包括膀胱癌在內的多種癌癥有關，會提高多種癌癥的發生風險[11]。依澤麥布作為降低血膽固醇水平的藥物被使用。有生物學家與臨床醫生擔心其是否會導致癌癥的發病率升高。與擔憂相反，有報道稱依澤麥布能抑制腫瘤血管的生成[10]。我們的研究發現，依澤麥布能有效抑制膀胱癌細胞的增殖與遷移，并阻滯其細胞周期在G0/G1期。

通過MTT法發現對兩種膀胱癌細胞系使用不同濃度依澤麥布處理48 h，能抑制其增殖，且呈劑量依賴性。流式細胞術的結果也顯示依澤麥布使細胞被阻滯在G0/G1期，參與G0/G1期調控的蛋白(CDK4、CDK6)在藥物的處理下，其蛋白豐度也有不同程度的下降。CDK4/6是細胞周期從G1期進入S期的關鍵調控因子[12]。而CDK4/6表達下降將阻礙細胞周期進入S期，從而使細胞周期發生阻滯，最終影響細胞增殖。由此我們推論，依澤麥布能阻滯膀胱癌細胞周期在G0/G1期，從而抑制膀胱癌細胞的增殖。

依澤麥布可能通過抑制上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)來抑制細胞的遷移能力。劃痕實驗提示依澤麥布能抑制膀胱癌細胞的遷移，免疫印跡分析的結果也證實依澤麥布下調了EMT相關蛋白β-catenin及Vimentin的表達。EMT過程與腫瘤的侵襲和轉移密切相關，近年來，波形蛋白被認為是EMT的標記物[13]，波形蛋白也可作為早期診斷膀胱移行細胞癌的重要指標。β-catenin是細胞粘附連接不可或缺的結構成分，在癌癥進展相關的轉變中，β-catenin的激活可以通過增強轉錄對EMT進展產生影響[14]。可見，依澤麥布可能是通過影響EMT來抑制膀胱癌細胞的遷移能力的。

綜上所述，依澤麥布能有效遏制膀胱癌細胞的增殖與遷移，阻滯其細胞周期在G0/G1期，可能成為一種新型的膀胱癌治療藥物。