低氧聯合GDNF誘導大鼠神經干細胞分化為TH陽性神經元的實驗研究

杜 娟，劉昌紅，梁 輝，呂曉紅

神經干細胞(NSCs)作為干細胞的一種，具有自我更新及多向分化潛能，因此在神經系統疾病的移植治療過程中，NSCs成為移植細胞的潛在來源。而NSCs的存活、增殖、分化以及遷徙過程均受到局部復雜微環境等因素的影響，氧濃度是NSCs所處微環境中重要的因素之一，且體內多種組織特別是含有干細胞的組織中氧濃度遠遠低于大氣氧濃度[1,2]。

低氧可以影響NSCs的增殖及分化[3]，且主要向多巴胺能神經元分化，但影響NSCs向多巴胺能神經元分化的最適低氧濃度尚無定論。本實驗利用特定的誘導因子在低氧條件下對NSCs進行誘導分化，從而明確NSCs向多巴胺能神經元分化的最適低氧濃度并獲得目的細胞，為神經系統變性疾病的治療提供了新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級孕14～16 d Wistar大鼠由吉林大學動物中心提供(SCXK-(Ji)2003-0001)。

1.2 試劑 培養基DMEM/F12,B27(Gibco),堿性成纖維細胞生長因子(bFGF),表皮細胞生長因子(EGF)和膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)(Peprotech),FBS(杭州四季青公司),dbcAMP(Santa),兔抗鼠神經元特異性中間絲(Nestin)(武漢博士德公司)，兔抗鼠5-溴脫氧尿苷(Brdu)(武漢博士德公司)，兔抗鼠絡氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體(武漢博士德公司)，山羊抗兔免疫組化試劑盒(武漢博士德公司)，FITC標記山羊抗兔IgG(武漢博士德公司)。

1.3 神經干細胞的體外分離及原代培養 神經干細胞的體外分離與培養 取妊娠14～16 d的Wistar大鼠,給予乙醚吸入麻醉,無菌操作取出胚胎,置于冰浴的無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)內,分離胚胎中的腦組織,小心剝離腦膜及血管,將取出的腦組織剪成小組織塊,加入0.125%胰蛋白酶消化30 min左右,用含10%胎牛血清終止消化， 0.01%DNaseI繼續對腦組織消化30 min左右，離心,將離心后的細胞懸浮于干細胞培養基中,培養基包含bFGF 20 ng/ml和EGF 20 ng/ml及DMEM/F12培養基(另含2% B27,HEPES10 mmol/L,谷氨酰胺2 mmol/L,青霉素100 U/ml,鏈霉素100 U/ml),調整細胞密度至5×105/ml,接種至25 ml培養瓶。在37 ℃飽和濕度、5% CO2/95%空氣的二氧化碳培養箱中培養。每2～3 d半量換液一次,7 d傳代一次。

1.4 神經干細胞的鑒定 待培養至1 w左右時取細胞懸液1瓶，細胞離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細胞克隆，注意力度要適當均勻，重新細胞計數后以5×104/ml接種于裝有細胞爬片的24孔板內，進行Nestin及Brdu鑒定。

1.5 不同低氧濃度下GDNF體外誘導NSCs 各實驗組均應用凍存的第3代細胞，保證細胞的同源性。細胞復蘇步驟如下：凍存管置于39 ℃～40 ℃水浴搖晃，1 min內融化；吸入離心管，加培養液至10 ml，輕輕混勻，離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，重新細胞計數后以5×105/ml接種于25 cm2培養瓶內，繼續常規培養。實驗分組：實驗組A常氧環境下(20%氧氣)GDNF誘導組；實驗組B 10%氧氣環境下GDNF誘導組；實驗組C 5%氧氣環境下GDNF誘導組；實驗組D 3%氧氣環境下GDNF誘導組；實驗組E 1%氧氣環境下GDNF誘導組實驗組A取出第3代凍存細胞復蘇后培養1 w左右培養瓶內細胞懸液，細胞離心(1000 rmp,5 min)后棄上清，重懸，吸管吹打分離細胞克隆，注意力度要適當均勻，重新細胞計數后以5×104/ml密度接種于裝有細胞爬片的24孔板內，每孔1.5 ml，以GDNF20 μg/L(每孔需分別添加GDNF儲存液15 μ)進行誘導，共8孔，另外8孔添加等量PBS，24 h后加5-FU(每孔需分別添加5氟尿嘧啶儲存液1.5 μl)，每2～3 d半量換液，7 d后終止誘導,進行TH細胞鑒定。實驗組B、實驗組C、實驗組D、實驗組E均在不同氧濃度的缺氧培養箱中進行，余處理相同。

2 實驗結果

2.1 孕14 d～16 d wistar大鼠無血清培養 應用無血清培養液培養神經干細胞，24 h可見大部分細胞分裂成3～4個的細胞球，且懸浮生長，隨著時間推移，細胞球體積逐漸增大，數量增多，折光性較好，球體形狀規則，5～6 d時少量神經球貼壁生長，并向外伸出突起。

2.2 Nestin鑒定 收集傳代至第3代的神經干細胞培養至1 w左右時制作細胞爬片，進行免疫細胞化學染色鑒定，結果示神經球呈現棕黃色，而對照組基本無著色，差異明顯，表明細胞具備干細胞特性。

2.3 Brdu鑒定 收集細胞前24 h給予Brdu，后制作細胞爬片，行免疫細胞化學染色，結果示神經球呈現棕黃色，而對照組基本無著色，差異明顯，表明細胞具備干細胞增殖分化的能力。

2.4 不同氧濃度下GDNF誘導神經干細胞分化 在常氧、1%O2、3%O2、5%O2、10%O2環境下加入GDNF20 μg/L，分化1 w時平均陽性率分別為9.78%、14.56%、25.54%、14.17%、11.10%。1%O2、3%O2、5%O2組與常氧對照組相比較具有顯著統計學差異(P<0.01)；10%O2組與常氧對照組相比較無統計學差異；3%O2組與1%O2組、5%O2組相比較具有顯著統計學差異(P<0.01)，而1%O2組與5%O2組相比較無統計學差異，即在3%O2濃度下神經干細胞向多巴胺能神經元分化比率最高(見表1、圖1)。

表1 不同氧濃度下GDNF誘導分化后多巴胺能神經元比率

不同氧濃度組與對照組相比*P<0.01

3 討 論

傳統觀點認為，中樞神經系統的神經細胞是一種終末細胞。在神經系統疾病中，大部分病理過程如創傷、中毒及缺血缺氧等引起的神經元丟失都是不可逆的。因此，神經干細胞移植成為頗具前景的治療手段，而充足、安全、可靠的NSCs是細胞移植的前提。有研究顯示，運用細胞移植治療相關神經系統疾病時，向疾病模型移植入向特定神經元方向分化的NSCs比移植入未分化的NSCs癥狀改善明顯[4]。

目前，大部分NSCs培養均在常氧環境下進行，即與大氣中氧濃度(21%，160 mmHg)相同，但NSCs在生物體內所處氧環境并非如此。如骨髓間充質干細胞所處的微環境中氧濃度約為1%～7%。已有大量研究顯示，低氧可以促進神經干細胞增殖[5,6]，對抗其凋亡[7]，對其分化方向也有一定誘導作用，且主要向多巴胺能神經元分化[8]。低氧環境下獲得足夠的多巴胺能神經元也一度成為研究的熱點，但既往的研究大部分在3%氧濃度環境下進行，但對于NSCs向多巴胺能神經元分化的最佳低氧濃度尚無系統研究。本實驗著重研究NSCs向多巴胺能神經元分化的最佳低氧濃度。本實驗中設立21%、10%、5%、3%、1%5個氧濃度梯度，結果顯示在10%氧濃度時NSCs向多巴胺能神經元分化率與常氧組相比無明顯提高；5%及更低氧濃度時NSCs向多巴胺能神經元分化率明顯提高，與常氧組相比實驗結果具有顯著統計學意義，但各低氧組之間比較分化率與氧濃度梯度無線性相關性；3%O2組與1%O2組、5%O2組相比具有顯著統計學差異(P<0.01)，而1%O2組與5%O2組比較無統計學差異，即在3%O2濃度下神經干細胞向多巴胺能神經元分化比率最高。分析原因，可能是因為3%的氧濃度更易于啟動神經干細胞向多巴胺能神經元分化的各項調控機制。而Studer L的研究中，低氧組NSCs向多巴胺能神經元分化率高達56%，后期研究很少能達到該比例，最主要的原因可能為取材部位不同，NSCs在胚胎腦組織中很多區域均有分布，而不同區域的NSCs分化時也有不同趨向，特別是胚胎后期，NSCs的多向分化潛能下降，更易向特定類型的神經元分化，例如中腦來源的NSCs更易分化為TH陽性神經元[9]。另外，低氧可以促進NSCs增殖，故增殖期低氧可增加NSCs基數，也有研究顯示，低氧狀態下延長增殖時間可以增加人類胚胎中腦前體細胞向TH陽性神經元的分化[10]，故低氧處理時間及處理階段、統計學處理不同也可以導致結果的差異較大。

低氧促進NSCs分化為多巴胺能神經元的機制非常復雜，目前研究所得結論主要集中于以下幾方面。首先，低氧可以促進NSCs中某些細胞因子的合成。在此過程中，HIF-1在細胞表型及功能特征方面起決定性作用。HIF-1是氧濃度對神經干細胞增殖及分化調節過程中重要的細胞因子，有α和β兩個亞基。HIF-1α是調節細胞缺氧適應過程中重要的轉錄激活因子，在多數細胞和組織中，其含量很低，在胞質內處于失活狀態；但是在缺氧條件下其含量則升高，可被激活并轉移到細胞核并與HIF-1β形成HIF-1 分子，識別并結合包含有低氧反應元件的DNA序列[11]。其次，低氧引起基因水平的改變。低氧狀態下，Wnt通路在NSCs分化為多巴胺能神經元過程中起重要作用[12]，同源異形盒轉錄因子Eng railed(En)家族成員En1和En2在后期維持中腦DA能神經元方面起重要作用，而Wnt1 能促進二者在大腦黑質和腹側被蓋區表達。在多巴胺能神經元的成熟方面，低氧促進mRNA表達更多的EPO和P27，而這些也影響神經細胞的分化，同時，Nurr1和Pitx3以及DA相關轉運RNA的表達也上調，而這些與多巴胺能神經元的成熟有關。有研究顯示，在3%～5%條件下培養出的多巴胺能神經元具有更多的突起，且突起較正常氧條件下更長，表型更成熟[13]。另外，在低氧條件下，D3和D4型突觸后多巴胺受體的轉錄也會受影響。此過程中，可能涉及慢反應缺氧敏感的轉錄因子參與[14]。細胞因子和基因水平的調控密不可分，HIF-1α缺失會使Wnt/β-catenin信號通路受抑制，從而使干細胞的增殖、分化及成熟受累[15]。HIF-1還可以結合酪氨酸羥化酶mRNA啟動子，進一步調控酪氨酸羥化酶基因的表達，從而使酪氨酸羥化酶的合成增加。第三，低氧本身減輕了氧化應激效應[16]，對NSCs起到保護作用，減少其凋亡的同時促進其增殖，從而增加了NSCs向多巴胺能神經元分化的基數。當然，分化出的多巴胺能神經元是否成熟，功能如何，能否分泌多巴胺，這些需進一步研究，本研究旨在低氧對NSCs分化方向的影響。另外，GDNF是1993年Lin等發現的一種神經營養因子，是轉化生長因子家族中的一員。主要分布于中樞神經系統中腦多巴胺區域，GDNF不僅在神經干細胞分化為多巴胺能神經元中起著重要作用，而且對多巴胺能神經元也具有營養、支持、保護和修復作用[17]。曾有研究顯示GDNF誘導人類神經元祖細胞分化后，TH陽性細胞比例達50%，對照組分化比例僅為2.9%(P<0.05)[18]。本實驗中低氧聯合GDNF誘導NSCs分化為多巴胺能神經元的比例最高僅達30%，分析可能與取材部位、GDNF來源及劑量、誘導分化時間不同有關。

氧濃度對NSCs增殖和分化的研究使得干細胞學科更加完善和深入，并且必將推動神經干細胞移植治療的進一步發展，尤其是在缺血缺氧性腦卒中中的應用與研究。雖然低氧條件下的NSCs培養實驗已取得一定進展，但仍存在很多的未知，這需要我們進一步的研究。