黑麥草對幾種Cd污染鈍化劑的生物學響應研究

燕傲蕾，孫玉喜，田 宇，張 婷，陸景磊

(亳州學院 生物與食品工程系，安徽 亳州 236800)

土壤是人類賴以生存的物質基礎，目前我國現有耕地近20%已遭受重金屬污染[1]，生態環境部發布的《2019中國生態環境狀況公報》明確指出“影響農用地土壤環境質量的主要污染物是重金屬污染，其中鎘為首要污染物”。鎘(Cd)生物毒性高、轉移性強，容易通過食物鏈進入人體，近年來，貴州赫章、湖南衡東、江西贛州多地均發生農作物重金屬鎘超標事件，土壤Cd污染問題已對農產品質量安全和人類健康構成了嚴重威脅。目前治理土壤重金屬污染的思路之一是原位鈍化技術，即通過向土壤中添加一些可吸附重金屬的材料，降低重金屬元素在土壤環境中的遷移性及其生物可利用性，最終減少植物對重金屬的吸收和累積[2]。重金屬鈍化修復操作簡單、不影響作物生產、適合大面積推廣，是土壤重金屬污染修復最有效的方法之一[3]。

目前，曾卉、計海洋等研究者在土壤鈍化材料的篩選、鈍化劑對重金屬的吸附特征等方面均進行了一定的研究[4-6]，筆者也從不同類別的鈍化劑中選擇了秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣和蛭石四種鈍化劑，通過裸土實驗研究了不同鈍化劑對亳州地區土壤性質和養分狀況的影響。但是，鈍化劑對重金屬污染土壤的實際修復效果，檢驗的最終標準應該體現在植物指標上，陳望舒、Zama等也提出應加強鈍化材料對植物生長生理等生物學實際效果的研究[7-9]。黑麥草(LoliumperenneL.)生長迅速，易于播種，對重金屬耐性較強，在環境治理中具有指導意義[10]。因此，本文通過黑麥草盆栽實驗，系統的研究在亳州Cd污染土壤基質中，添加四種鈍化劑對黑麥草生長、生理指標的影響，以生物指標評價四種鈍化劑對亳州地區土壤Cd污染的鈍化效果，為亳州地區Cd污染的鈍化修復奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

供試土壤為安徽省亳州市近郊某藥材種植基地0～20 cm深度的耕作層土壤，土壤基本性質為pH 7.70，有機質含量12.26 g/kg，全氮1.20 g/kg，硝態氮0.031 g/kg，有效磷0.014 g/kg，速效鉀 0.179 g/kg。

實驗所用秸稈炭(AC)由南京智融聯科技有限公司提供，由小麥秸稈在400 ℃條件下限氧裂解獲得(專利號：200920232191.9)，腐殖酸(HA)、硅酸鈣、蛭石均購自合肥博美藥品有限公司。

供試植物1年生黑麥草(LoliumperenneL.)種子由艾通園林有限公司提供。

主要儀器設備：紫外可見分光光度計(上海元析 UV6100)；電導率儀(梅特勒 S230-USP/EP)。

1.2 實驗設計

土壤采集后自然風干、除雜，過10目尼龍篩，稱取500 g置于花盆中，以溶液形式添加CdCl2使土壤Cd含量(以風干土中的Cd2+計)為5 mg/kg，混合均勻后老化備用。土壤老化15 d后，在四個實驗組中分別添加秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣、蛭石，每種鈍化劑均設置1%、3%、5%三個添加濃度，另設不添加鈍化劑的Cd污染土壤一組作為空白對照，以上每種處理均設3組重復，土壤穩定15 d備用。

土壤準備完成后，挑選大小均勻、顆粒飽滿的黑麥草種子，每盆播種50粒，待種子出苗后繼續培養30 d，培養期間通過重量法保持60%～70%的田間含水量。培養結束后，將黑麥草小心連根取出，自來水沖洗干凈后用濾紙吸干備測。

1.3 樣品分析

每盆隨機抽取15株黑麥草，用刻度尺進行黑麥草根部和地上部分的長度測定，計算耐性指數。

葉片電導率(EL)的測定：將葉片剪成長約1 cm小段置于三角瓶中，按1∶10的比例加雙蒸水，以400次/min的速度振蕩1 h后，用電導儀測定溶液電導率。

膜脂過氧化物丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法進行測定[11]：取0.5 g鮮葉，加 5 mL5%TCA進行研磨，所得勻漿3000 r/min離心10 min后取上清液2 mL，加 0.67%TBA 2 mL，混勻后沸水浴30 min，冷卻后再離心一次，取上清液在450 nm、532 nm、600 nm下測定其吸光度。

葉綠素含量參照李合生的方法[12](P134-P137)：取0.2 g鮮葉剪碎，加少量石英砂、碳酸鈣粉和2～3 mL80%丙酮研成勻漿，再加80%丙酮10 mL研磨至組織變白。靜置5 min后過濾至25 mL棕色容量瓶定容。以80%丙酮為空白在665 nm、649 nm和470 nm下測定葉片葉綠素提取液的吸光度。

1.4 數據處理

耐性指數(Tolerance Index)= 實驗組根系平均長度/對照組根系平均長度變化率(Rn)=(Xn-X0)/X0×100%。其中，X0為空白組指標數值，Xn為各實驗組土壤對應指標數值。

所有數據均采用SPSS 17.0統計軟件對實驗數據進行統計分析，計算平均值、標準差并進行差異顯著性分析(LSD法)和相關分析，采用Origin 8.0 進行制圖。

2 結果與分析

2.1 四種鈍化劑對黑麥草生長指標的影響

莖葉長和根長能直觀反應黑麥草的生長狀況。從表1可以看出：秸稈炭組莖葉長和根長均值均高于空白組，耐性指數均高于1，且長度指標和耐性指數隨秸稈炭添加濃度的上升表現出先上升后下降的趨勢，在3%添加量下達到最大值，莖葉長和根長分別比空白高17.70%和21.12%，與空白組存在顯著差別(P<0.05)；腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組長度指標和耐性指數則隨著鈍化劑添加濃度的上升而下降，在1%添加量下，腐殖酸組莖葉長和根長分別比空白高12.47%和16.11%，與空白組差異明顯(P<0.05)，蛭石組莖葉長和根長均值也略高于空白，但差異未達到顯著程度(P>0.05)，硅酸鈣組莖葉長和根長均值普遍低于空白組，當硅酸鈣添加量達到3%時，莖葉長和根長均顯著低于空白組(P<0.05)，在5%硅酸鈣組中，莖葉長和根長比空白組降低了13.08%和19.88%，耐性指數達到最低值0.80。對比同一添加濃度下不同鈍化劑對黑麥草的影響，在1%添加濃度下，黑麥草長度指標和耐性指數為腐殖酸組>秸稈炭組>蛭石組>硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P>0.05)，在3%和5%添加量下黑麥草長度指標和耐性指數為秸稈炭組>腐殖酸組>蛭石組>硅酸鈣組，3%組中，秸稈炭組長度指標顯著高于其他組，5%組中，硅酸鈣組長度指標顯著低于秸稈炭和蛭石組(P<0.05)。

表1 四種鈍化劑對黑麥草生長指標的影響

2.2 四種鈍化劑對黑麥草生理指標的影響

2.2.1 四種鈍化劑對黑麥草葉片電導率的影響

植物在逆境脅迫下，細胞膜的通透性發生改變，導致胞內電解質滲出，電導率升高。因此，電導率可用于判斷細胞膜受害的程度，是衡量植物抗性的重要指標，在植物抗逆性研究中應用十分廣泛[13-14]。從圖1可以看出，在1%濃度下，電導率表現為腐殖酸組<秸稈炭組<蛭石組<硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P>0.05)，且各鈍化劑組電導率均低于空白組。隨著鈍化劑添加量的提高，秸稈炭組葉片電導率先下降后上升，電導率變化率在3%濃度下達到最小值-9.18%；腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組的電導率則表現出上升趨勢，在3%和5%濃度下，電導率均為秸稈炭組<蛭石組<腐殖酸組<硅酸鈣組，硅酸鈣組電導率水平顯著高于秸稈炭組(P<0.05)。

圖1 四種鈍化劑對黑麥草電導率變化率的影響

2.2.2 四種鈍化劑對黑麥草葉片MDA含量的影響

膜脂過氧化水平反應細胞內活性氧的累積程度，影響植物細胞代謝狀況[15]，MDA作為膜脂過氧化產物，其含量能反應細胞膜的損傷程度，是衡量細胞膜脂質過氧化程度的重要指標[16]。比較不同鈍化劑對黑麥草葉片MDA含量的影響(圖2)可以看出：MDA含量在1%濃度下為秸稈炭組<腐殖酸組<蛭石組<硅酸鈣組，在3%和5%濃度下為秸稈炭組<蛭石組<腐殖酸組<硅酸鈣組。添加活性炭降低了黑麥草葉片細胞中MDA的含量，且降幅在3%秸稈炭組最大，達到20.95%，3%秸稈炭組的MDA水平顯著低于同濃度的其他鈍化劑組(P<0.05)；腐殖酸和蛭石組MDA含量僅1%濃度下略低于空白，硅酸鈣組MDA含量則在各濃度下均高于空白組，且腐殖酸、硅酸鈣和蛭石組MDA含量均隨著添加濃度的上升而上升，在5%濃度下，腐殖酸、硅酸鈣和蛭石組MDA增幅分別達到15.08%、29.54%和10.75%，MDA水平顯著高于秸稈炭組(P<0.05)。

圖2 四種鈍化劑對黑麥草MDA變化率的影響

2.2.3 四種鈍化劑對黑麥草葉綠素含量的影響

葉綠素是植物光合作用的重要物質，是植物實現無機物到有機物轉化的基礎，對植物自身和整個生態系統都具有重要意義。從黑麥草葉片葉綠素在四組鈍化劑處理中的變化情況(圖3)可以看出：在1%添加濃度下，葉綠素含量為腐殖酸組>秸稈炭組>蛭石組>硅酸鈣組，但組間差異不顯著(P<0.05)，且各鈍化劑組葉綠素含量均高于空白組。除秸稈炭組葉綠素含量隨鈍化劑添加量先上升后下降，在3%濃度時葉綠素升高19.57%外，腐殖酸組、蛭石組和硅酸鈣組葉綠素含量均隨鈍化劑濃度的上升而下降，在3%和5%濃度下，葉綠素含量分別為秸稈炭組>腐殖酸組>蛭石組>硅酸鈣組和秸稈炭組>蛭石組>腐殖酸組>硅酸鈣組，秸稈炭組葉綠素含量顯著高于硅酸鈣組(P<0.05)。

圖3 四種鈍化劑對黑麥草葉綠素變化率的影響

2.3 黑麥草生長、生理指標的相關性分析

在Cd脅迫下，植物往往表現出細胞膜過氧化水平升高，細胞膜透性增加，電導率上升，光合色素含量下降等現象，植物對Fe、Mn等礦質元素的吸收利用情況也發生變化，從而影響植物的生長和生物量的累積[17]。目前，表征植株對重金屬的耐性往往采用耐性指數，常通過計算實驗組與空白組根長之比來表示[18]，但是，黑麥草根系較為細弱，在種植過程中不同植株之間根系互相交錯，在取材時容易斷裂，獲得準確數值較地上部分難度更高。通過黑麥草在四種鈍化劑環境下的莖葉長、根長、電導率、MDA含量、葉綠素含量的相關性分析(表2)可以看出：黑麥草根長和莖葉長、葉綠素含量三者極顯著正相關(P<0.01)，根長、莖葉長、葉綠素含量與MDA含量、電導率極顯著負相關(P<0.01)，且電導率負相關程度最高。良好的土壤鈍化劑可以通過降低土壤重金屬可利用部分降低電導率水平和MDA含量，提高葉綠素的含量，從而促進植株地上、地下部分的生長。因此，采用黑麥草進行土壤Cd污染鈍化修復研究時，可以直接以地上部分生長狀況表征植株耐性，李希銘等的研究中也發現草坪草地上部分較根系對Cd等重金屬更敏感[19]，因此以黑麥草地上部分指標表征其耐受性更簡單靈敏。在植株材料有限的情況下，可選擇電導率或葉綠素含量來代表黑麥草的生理狀況，作為鈍化劑對重金屬污染修復的首選生物學指標。

表2 黑麥草生長指標、生理指標的相關性分析

3 結論

通過黑麥草盆栽實驗，我們發現秸稈炭在1%～5%各添加濃度均能降低黑麥草葉片電導率、MDA含量，提高葉片葉綠素含量，促進黑麥草莖葉、根系的伸長，提高黑麥草的耐性指數，且以3%秸稈炭添加量最佳，MDA含量和莖葉長、根長與同濃度其他鈍化劑組存在顯著差異；腐殖酸在1%添加量下電導率、MDA含量、葉綠素含量和黑麥草生長指標優于秸稈炭，但當添加量上升到3%后，腐殖酸組黑麥草葉片電導率和MDA含量快速上升，葉綠素含量、莖葉長和根長持續下降；蛭石在1%～3%濃度間，對黑麥草的生長指標和生理指標表現出有利影響，在5%濃度下，對黑麥草生長、生理指標表現出不利影響，但影響程度與其他鈍化劑相比較小；硅酸鈣僅在1%濃度下使黑麥草電導率降低、葉綠素升高，隨著添加量上升，電導率和MDA含量上升，長度指標、耐性指數和葉綠素含量持續下降，對黑麥草的生長表現出不利影響。

從黑麥草生物響應情況來看，在秸稈炭、腐殖酸、硅酸鈣、蛭石四種鈍化劑中，秸稈炭在所用亳州地區土壤中表現出良好的Cd鈍化修復能力，結合成本考慮，以添加量在1%～3%為宜；腐殖酸也有Cd鈍化修復的能力，但需要控制在1%左右的低濃度范圍，蛭石在Cd鈍化修復中作用不夠突出，變化幅度小，可以考慮將腐殖酸和蛭石可以作為復合鈍化劑的組分進行鈍化劑的優化；硅酸鈣在本實驗中整體表現不利于黑麥草生長的情況，不適合作為亳州地區土壤的Cd污染鈍化修復劑。莖葉長、電導率和葉綠素含量均可以作為黑麥草在土壤Cd污染鈍化修復效果研究中的首選生物學指標。